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UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA GENERAL Y LABORATORIO YOHANNA SARRIA GUZMÁN, Bact, MSc, PhD. Manual
Laboratorio de Microbiología de Alimentos
Firstname Lastname-Lastname 1 , Firstname Lastname-Lastname 1 , Firstname Lastname-Lastname 1 , Firstname Lastname-Lastname 1 and Lawdayann Valdez -Montes 1,(Lider)* (^1) Facultad de Ingeniería, Universidad de Cartagena, Cartagena de Indias, Bolívar, 130015, Colombia ***** Correspondence: e-mail@e-mail.com Recibido: xx-xx-2024 ; Retroalimentación: xx-xx-2024; Enviado: xx-xx- I. Normas de bioseguridad en el Laboratorio (por Lawdayann Valdez Montes)
1. Introduction La bioseguridad en el laboratorio ha cumplido un rol muy importante a lo largo del tiempo, al conocer y cumplir las normas para proteger nuestro bienestar físico, de salud e integral. Se puede definir, como un grupo de medidas preventivas que permiten controlar los factores de riesgo que provienen de agentes físicos, químicos, biológicos donde aseguren el desarrollo de procesos y procedimientos que no atenten contra la salud y seguridad de las personas, donde puedan actuar en distintos espacios y contra la conservación del medio ambiente [1]. Es fundamental el cumplimiento de cada técnica en el laboratorio, la forma en la que se trabaja en un área de cuidado como estas, es de mucho orden y sanidad. Es importante que antes de iniciar el uso del laboratorio conocer los espacios obligatorios que el área de trabajo debe tener a su disposición como, extintores, salidas de emergencia, lava ojos, ducha rápida, botiquín de primeros auxilios, acondicionamiento de alarmas y gabinete para contener derrames [2]. Esta práctica tiene como finalidad comprender, así mismo aplicar todas las normas de bioseguridad en el laboratorio y conocer la importancia de identificar los niveles de riesgo y bioseguridad que existen en estas áreas de trabajo [3]. 2. Materials and Methods Antes de ingresar al área de trabajo es importante que en la mayoría de casos cuenten con la siguiente indumentaria. Se usaran en todo momento batas cerradas o uniformes especiales para el trabajo en laboratorio; se usaran guantes protectores apropiados para todos los procedimientos que puedan dañar la piel al entrar en contacto directo, el personal deberá lavarse las manos después de manipular materiales o utensilios infecciosos, de igual modo antes de abandonar el laboratorio; se usaran gafas de seguridad, tapabocas, viseras, cofia u otro tipo de protección cuando sea necesario proteger los ojos y el rostro de salpicaduras o impactos hacia la piel; siempre deberán usar zapatos completamente cerrados y en una planta de alimentos, botas largas, blancas, a la altura de la rodilla; en la zona de trabajo estará prohibido, fumar, beber, comer, usar todo tipo de joyas y maquillajes, no menos importante evitar el contacto físico; del mismo modo, estará prohibido almacenar bebidas y alimentos en el área de trabajo; por último, deberán desinfectar el área de laboratorio antes y después de la realización de la práctica, esto con el fin de que los microorganismos que se encuentran en la superficie no interfieran en el proceso [4]. 3. Results esperados En el desarrollo de la práctica el estudiante tendrá la capacidad de manejar a la perfección el tema de las normas y su aplicación en el laboratorio, del mismo modo se
espera que este tenga conocimiento de las consecuencias que traen las malas prácticas de higiene y el mal uso de la indumentaria a la hora de trabajar en el espacio destinado. Al iniciar deberán tener en cuenta las siguientes recomendaciones: el laboratorio debe estar limitado y con un aforo mínimo de personas a la hora de realizar experimentos; estará prohibido pipetear con la boca a la hora de extraer o agregar líquidos, deberán utilizar dispositivos mecánicos o automáticos, todos los procedimientos se llevarán a cabo con precaución a fin de minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles [5]. Los estudiantes encontraran reactivos en el área previamente alejados de la zona, es esencial que este tipo de sustancias químicas la maneje el encargado de laboratorio; el uso de vidrio y utensilios delicados serán utilizados cuidadosamente, en caso de romper dar aviso inmediato; hallaran mecheros, encender el que utilizaran y evitar contacto directo con el fuego, impedirán jugar con el agua destilada o las muestras a examinar; deberán utilizar kit de uso grupal que servirá para el desarrollo de la misma (tijeras, cinta, alcohol, algodón, mechera y bolsas); el estudiante por medio de pequeñas muestras alimentarias identificara diferentes tipos de microorganismos, por esto la importancia de mantener todo limpio, esterilizado y desinfectado cada vez que sea necesario; se encontraran con accidentes donde se vea afectada la piel, si esto sucede acudir a la ducha o lava ojos de inmediato, en el caso de cortadas al botiquín, a su vez, a los extintores y rutas de evacuación en caso de emergencia. Todos estos accidentes se pueden prevenir si actuamos de manera adecuada. Figure 1. ¿ cómo estar seguros en el laboratorio? [6].
4. Preguntas complementarias Responder las siguientes preguntas 1. ¿cuántos niveles de bioseguridad conoces? Menciónalos. 2. ¿Por qué consideras que es importante, capacitar a las personas antes de ingresar al laboratorio? 3. ¿Cuáles son los tipos de riesgos que existen? De ejemplos. 4. Mencione un tipo de accidente en laboratorio que conozca. 5. ¿Que son las BPM? References 5 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81
Una vez transcurrido el tiempo de incubación se espera la presencia o ausencia de producción de gas en cada uno de los 9 tubos de ensayo. La formación de burbujas en la campana de Durham indicará la producción de gas como resultado de la actividad metabólica de los microorganismos presentes en las diferentes diluciones [4], esta presencia puede ser alta o baja o nula si tiene ausencia. Si resulta ser positiva la presencia de gas se compararán las distintas diluciones (10 a la -1, 10 a la -2, y 10 a la -3) para evaluar cómo varía la producción de gas en cada una. Esto permitirá determinar la concentración óptima para el crecimiento bacteriano, es decir, en qué dilución los microorganismos han encontrado las condiciones más favorables para su desarrollo y producción de gas. La presencia o ausencia de producción de gas en cada dilución proporcionará información sobre la actividad metabólica de los microorganismos en diferentes condiciones. Por ejemplo, una dilución con mayor producción de gas podría indicar una mayor actividad metabólica y un mayor número de microorganismos viables en esa muestra. También se podrán identificar posibles diferencias en la capacidad de producción de gas entre las distintas diluciones. Esto podría indicar variaciones en la composición de la muestra o en la presencia de diferentes tipos. De igual manera, si hay cambio a color amarillo, este nos indicará que hay crecimiento de coliformes totales, son positivas y las que no cambian de color no hay crecimiento, es decir, es una prueba negativa [5]. En conclusión, el procedimiento permitirá obtener información sobre la actividad metabólica y la capacidad de crecimiento de los microorganismos presentes en la muestra. Además, ayudará a determinar la concentración óptima para el cultivo de bacterias y a identificar posibles variaciones en la composición microbiana de la muestra.
4. Preguntas complementarias 1. ¿Cuál es el procedimiento específico para identificar coliformes totales en muestras de agua según el método descrito? 2. ¿Por qué es importante detectar la presencia de contaminación fecal en cuerpos de agua y cuáles son los riesgos para la salud humana asociados con estos microorganismos? 3. ¿Cómo se interpretan los resultados de la formación de gas en los tubos de ensayo durante la incubación? 4. ¿Cuál es la importancia de la variación en la producción de gas en las diferentes diluciones de la muestra? 5. ¿Cuál es la relevancia práctica de este método para la industria alimentaria y la seguridad de los alimentos destinados al consumo humano? References [1] Fernández-Santisteban, María Teresa. Determinación de coliformes totales y fecales en aguas de uso tecnológico para las centrífugas ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. 51, núm. 2, marzo-agosto, 2017, pp. 70- [Internet]. Redalyc.org. [citado el 28 de febrero de 2024]. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/2231/223154251011.pdf [2] Mireya del Pilar Arcos Pulido. Indicadores microbiológicos de contaminación de las fuentes de agua. [citado el 28 de febrero de 2024]. Disponible en: http://file:///C:/Users/DELL/Downloads/47-Texto%20del%20art %C3%ADculo-297-1-10-20140327.pdf [3] Larrea-Murrell, Jeny Adina; Rojas-Badía, Marcia María; Romeu-Álvarez, Beatriz; Rojas-Hernández, Nidia Mercedes; Heydrich-Pérez, Mayra. Bacterias indicadoras de contaminación fecal en la evaluación de la calidad de las aguas: revisión de la literatura. Revista CENIC. Ciencias Biológicas, vol. 44, núm. 3, 2013, pp. 24-34. 3. Redalyc.org. [citado el 28 de febrero de 2024]. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/1812/181229302004.pdf 11 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185
[4] 4. M-S-Lc-I C. INSTRUCTIVO DE ENSAYO [Internet]. Gov.co. [citado el 28 de febrero de 2024]. Disponible en: http://sgi.ideam.gov.co/documents/412030/35488871/M-S-LC-I062+INSTRUCTIVO+DE+ENSAYODETERMINACI %C3%93N+Y+CUANTIFICACI%C3%93N+DE+COLIFORMES+TOTALES+Y+E+v3.pdf/2e67dbfd-3026-4206-b0a3- 32ff4e4bbe4a?version=1. [5] 5. 3-2-2- Recuento por el número más probable de coliformes totales y de coliformes fecales (NMP-HACER LA TABLA Y EL ENLACE) [Internet]. Ugr.es. [citado el 28 de febrero de 2024]. Disponible en: https://www.ugr.es/~pomif/pom-ali/ma-i/ma-i-3-nmp_recuento.htm I. E. Coli (por Karol Vanessa Guevara León) Introduction
1. Escherichia coli ( E. coli ) descrita por primera vez por Theodor Escherich en 1885 y se considera un habitante usual del tracto intestinal humano y de los animales de sangre ca-liente [1]. E coli es una bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, Es un bacilo y Gram negativo, el cual se encuentra principalmente en el intestino humano [2] Aparte, también es capaz de colonizar el tracto urinario, ya que puede sobrevivir en multitud de entornos, debido a su rápido crecimiento, tanto en condiciones aerobias como anaerobias, y a su capacidad para metabolizar una gran variedad de fuentes de carbono[3]Todo esto hace de E. coli un patógeno muy versátil, transmitido a los humanos, por la ingesta de alimentos contaminados frecuentemente se trata de alimentos poco cocinado o zumo sin pasteurizar [4]. Produce enfermedades diversas, Por todo lo mencionado, y sobre todo por su gran capacidad de adaptación, E. coli es importante y hace que esta bacteria sea más estudiada en la actualidad, lo cual ha tenido un impacto en los sistemas de salud, y en la producción agrícola, puesto que la vía de transmisión más habitual de la bacteria involucra tanto en los alimentos, y profesionales trabajando en cadenas de producción. 2. Materials and Methods Ingresar al laboratorio con las normas de bioseguridad, con todos sus implementos de trabajo, desinfectar el área correspondiente a cada grupo. Tomar algodón y alcohol para limpiar el área de trabajo, encender el mechero correspondiente al área de trabajo. Cada muestra se hará cerca del mechero para no tener contaminación alguna. Llevar una muestra 11 ml dicho por la profesora, y adicionarla en un Erlenmeyer que contiene 99 ml de agua de peptona, revolver suavemente y dejar reposar. muestra llamada 10-1, Tomar 2 tubos de ensayo muestra que es 10-2 y 10- y se le adicionara con una pipeta de la muestra de la 10-1 un 1 ml a cada una, Tomar de la muestra 10-2 ,1ml de la dilución adicionando con otra pipeta, para no contaminar en 3 tubos de ensayo, repetirlo a la muestra 10-3. Y colocarlos en unas granadillas y márcalos. En 3 cajas de Petri con el agar EMB sembrar con el asa las diluciones de las muestras con cuidado, cerca del mechero para no contaminar, empacar, muestra en bolsas ziplop y marcarlas con cada uno de los integrantes del grupo, incubar a temperatura de 37°-40°c por 24 horas, identificar las colonias de escherichia E. coli 3. Results esperados 14 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231
6. Salinas, P.; Moraga, R.; Santander, E; Siel-Feld, W. 2010. Presencia de cepas diarrogénicas de E.coli y estudio de genes de virulencia aislados desde fecas de dos poblaciones de lobo marino común, Otaria flavescens enel norte de Chile. Rev. Biol. Mar. Ocean. 45(1):153- **I. Clostridium (por Nora Ortega Gomez)
- Introduction** Las pruebas microbiológicas de los alimentos evalúan su calidad y vida útil. Para lograr este objetivo se deben utilizar técnicas que faciliten la identificación de los micro-organismos que se encuentran en dichas matrices alimentarias [1]. El género Clostridium se define como una bacteria Gram positiva, que es una bacteria anaeróbica rígida, inmóvil y formadora de esporas [2]. Todas las bacterias estrictamente anaeróbicas se limitan a vivir en zonas pobres en oxígeno, como en el fondo de los lagos o en los intestinos de los animales, pero forman esporas resistentes al oxígeno, a excepción de Clostridium perfringens, que también se encuentra en el agua, suelo y los alimentos, especialmente en las carnes rojas y las aves, este patógeno puede causar intoxicación ali- mentaria en humanos. El motivo de la propagación de este patógeno es la temperatura incorrecta después de la preparación del producto, esto sucede durante el enfriamiento y el almacenamiento. El propósito de esta práctica es detectar la presencia de bacterias re- ductoras de sulfito Clostridium en productos cárnicos. Identificar las características mor- fológicas de esta bacteria y conocer los principios y propiedades del medio SPS (sulfadia- zina polimixina sulfato). Además de comprender cómo aparece este patógeno y saber cuándo un alimento es o no apto para el consumo humano, es importante comprender e identificar este patógeno [2]. 2. Materials and Methods Al ingresar al laboratorio se obedecerán las normas de bioseguridad y se desinfec- tara el área de trabajo con ayuda de alcohol y algodón además se procederá a encender el mechero para evitar una posible contaminación. Para esta práctica de análisis de clos-tridium sulfito reductor se utilizara la técnica de recuentro de placa, se deberá traer una muestra de carne( roja o de ave)(en estado de descomposición preferiblemente) Se tomaran 11g de muestra y se sumergirá en un Erlenmeyer el cual tendrá 99ml de agua peptonada y se dejara reposar durante 5 min , siendo esta la disolución 10-1, con la misma pipeta se transferirá 1 ml de la disolución inicial a un tubo de ensayo el cual tendrá 9ml del dilu- yente, y se obtendrá la disolución 10-2. Luego cambiando la pipeta de tomara 0,1 ml de la disolución inicial y se colocara en una placa de Petri a la cual se adicionaran agar SPS (sulfato polimisina sufladiazina), se repetirá con esto con la disolución 10-1 y 10-2, luego dejar que el agar se solidifique y se llevara a la incubadora previamente marcadas a 37C durante 48 horas y pasado el tiempo se realizara el recuento de las colonias sulfito reduc-toras (negras).
- Results esperados Después de las 48 horas de incubación de las muestras se espera encontrar pre-sencia o ausencia de esporas pertenecientes a Clostridium perfringes en cada una de las placas de Petri con agar SPS el cual permitirá la detección de los organismos sulfi-to-reductores produciendo colonias negras, debido a los precipitados de sulfuro de hierro [3]. Podemos obtener resultados positivos o negativos esto dependerá de cuanta cantidad de esporas se encuentren en cada placa de Petri. Se realizara el recuento de las bacterias, el cual se va a obtener con la ayuda de una operación matemática la cual será multiplicando el número total de colonias encontradas en cada placa de Petri por el actor de dilución co- rrespondiente. En caso de que el resultado sea menor que 10 ufc/g o no se encuentre pre- sencia de colonias se entenderá que la muestra si es de buena calidad y si es mayor a 10 ufc/g será lo contrario. Se debe realizar la comparación con el número máximo permitido por la NTC 325 para un nivel de aceptabilidad o buena calidad microbiológica. [4]. 20 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339
4. Preguntas complementarias
- ¿Cuál es el valor permitido de clostridium sulfito-reductor para una matriz ali- mentaria según la normativa alimentaria? 2. teniendo en cuanta los resultados obtenidos después del análisis a la matriz ali- mentaria ¿su muestra cumple con la normativa alimentaria colombiana? References
- https://www.nutricienta.com/articulo/analisis-microbiologico-de-alimentos? expand_article=
- http://site.curn.edu.co:8080/jspui/bitstream/123456789/25/3/Guia%20de %20laboratorio%20Bromatolog%C3%ACa.pdf.
- https://www.bioser.com/productos/sps-agar-1317p/
- https://es.scribd.com/document/468610611/NORMA-TECNICA-COLOMBIANA- 1325 **II. Enumeración de bacterias aerobios mesófilos ( por Andrés Pestana )
- Introducción** Para este laboratorio se propone en determinar la calidad sanitaria de los productos alimentarios que se vaya a trabajar, además de las condiciones higiénicas de la misma (1). Hay que recordar que el crecimiento de estas bacterias se empieza a desarrollar a una temperatura optima de 20°C a 40°C con presencia de oxígeno (2), se trabajará en un medio de cultivo con un tiempo de 24 horas en incubación, un gran número de estos en los alimentos indican un rechazo a la hora del desarrollo, ya que, correría con la salud de los consumidores debido a ciertos microorganismos patógenos (3). Los recuentos en placa con siembra en profundidad que se va usar en este laboratorio, es el método más empleado y se expresa en Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por gramo o mililitro (4),posteriormente el tiempo de incubación se trabaja con un método de cálculo, se considera necesario contar las colonias que aparezca en cada caja de Petri donde están perfectamente aisladas, con eso aprender la cantidad de colonias mínimas aceptables a la hora de producción, hay que tener en cuenta que si están no cumple con los límites establecidos el producto no será aceptado a la hora de distribución. 2. Materiales y Métodos Se ingresará al laboratorio acatando las normas de bioseguridad y se procederá a desinfectar el de trabajo con alcohol y algodón, con ayuda de un encendedor se prende el mechero para evitar una posible contaminación. Se tomará una pipeta y se extraerá 1ml de un jugo de 11 a 10ml de su preferencia en la cual se agregará en un frasco de agua de peptona de 99ml en el cual hay que revolver suavemente (10^-1), después con la misma pipeta se agrega 1ml a un tubo de ensayo de agua de peptona de 9ml para una disolución (10^-2) y se descarta, tomando otra pipeta; se extraerá 1 ml de la primera disolución en dos caja de Petri con la primera disolución, ya que, después se agrega un poco de agar líquido de Baird Parker y esperamos para que gelatinice; luego con otra pipeta se hace lo mismo con otras 2 cajas de Petri, pero tomando muestras del tubo de ensayo con la segunda disolución, y volvemos a colocar agar líquido de Baird Parker, posteriormente esperamos que gelifique, se toma un poco de cinta y con un marcador se mete en una bolsa marcada, por último se guarda en la incubadora. 3. Resultados esperados Una vez que haya transcurrido el tiempo de incubación, esperamos encontrar colonias en cada placa de Petri. Se prevé que en la primera dilución se detecte una actividad microbiana, la cual puede ser alta o baja dependiendo del cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) durante la preparación. Esta actividad en la primera dilución podría influir en los resultados de la segunda dilución. Podemos esperar obtener resultados que sean altos, moderados, bajos o incluso la ausencia de actividad en las placas de Petri. Será necesario realizar el recuento de bacterias, el cual se obtiene multiplicando el número total de colonias encontradas en cada placa de Petri por el factor de dilución correspondiente. En el caso de que no se observe ninguna colonia en las placas de Petri de la dilución más concentrada, el recuento se expresará como inferior a 1 multiplicado por el factor de dilución más alto (5). Podremos comparar los resultados obtenidos en el laboratorio con los estándares de aceptación de UFC 23 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396
hockey y se distribuirá toda la muestra en las cajas de Petri con el fin de lograr su absorción y finalmente se utilizará el método de placa invertida a una temperatura de 37°C/h.
3. Results esperados Después de transcurrido el tiempo para el método de placa invertida se espera que la presencia de Staphylococcus confirme mediante técnicas de cultivo microbiológico, seguido de pruebas bioquímicas y moleculares identifique la especie específica, como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, entre otras. Se espera que los resultados se presenten en forma de recuento de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL) o por gramo (UFC/g) de muestra[3]. En general, se esperara identificar la presencia o ausencia de Staphylococcus en la muestra analizada, así como determinar la concentración o carga bacteriana si es relevante para el propósito del análisis [4]. Según estudios previos (Smith et al., 2018; Johnson y Brown, 2019), se esperará que las muestras positivas para Staphylococcus nos proporcionen características morfológicas y bioquímicas típicas de esta bacteria, como la formación de colonias redondas y de color blanco o amarillo en medios de cultivo selectivos [5]. En conclusión está determinación nos permitirá saber si el alimento analizado es apto o no para el consumo humano. 4. Preguntas complementarias 1. ¿Qué es Staphylococcus y por qué es importante en el ámbito de la microbiología? 2. ¿Cuáles son las características morfológicas y bioquímicas de Staphylococcus que nos ayudan a identificarlo en el laboratorio? 3. ¿Cuáles son los riesgos para la salud asociados con la contaminación de alimentos por Staphylococcus? 4. ¿Cuáles son los medios de cultivo selectivos utilizados para el crecimiento y la identificación de Staphylococcus? 5. ¿Qué medidas se deben tomar en caso de que se detecte Staphylococcus en una muestra alimenticia? References
- Foster TJ. Staphylococcus. En: Baron S, editor. Medical Microbiology. 4th ed. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8448/.
- Smith AB, Johnson CD. Microbiología: Fundamentos y Aplicaciones. 2ª ed. Editorial Científica; 2020.
- Smith AB, Johnson CD. Laboratory Determination of Staphylococcus. Microbiology Research Guide [Internet]. 2023 [accedido el 17 de febrero de 2024]; Resultados Esperados. Disponible en: http://www.microbiologyresearchguide.com/staphylococcus/results.
- Smith A, Jones B, García C. Identification of Staphylococcus species in clinical samples. J Clin Microbiol. 2018; 36(2): 123-
- Johnson D, Brown E. Molecular techniques for detection of Staphylococcus aureus. Methods Mol Biol. 2019; 1984: 45-60. Bacillus Cereus. **(por Mery Rico González)
- Introduction.** La presencia de Bacillus cereus, un microorganismo ampliamente distribuido en el ambiente, representa un desafío significativo en términos de seguridad alimentaria debido a su capacidad para producir toxinas que pueden ocasionar intoxicaciones alimentarias [1]. Es importante destacar que los alimentos a base de arroz cocido son comúnmente asociados con la presencia de este microorganismo [2]. Por lo tanto, se 29 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489
vuelve crucial el desarrollo de métodos efectivos de detección y cultivo para identificar la presencia de Bacillus cereus en los alimentos. En este contexto, el agar MYP (Mannitol Egg Yolk Polymyxin) se ha establecido como un medio de cultivo selectivo y diferencial para la detección de Bacillus cereus [3]. Esta guía de laboratorio tiene como objetivo proporcionar un protocolo detallado para el cultivo de Bacillus cereus a partir de muestras de arroz cocido utilizando agar MYP. Se describirán los pasos necesarios para la preparación del medio de cultivo, la inoculación de la muestra, la incubación de las placas y la observación de las colonias resultantes. Además, se discutirá la importancia de confirmar la identidad de las colonias y se proporcionarán pautas para el almacenamiento adecuado de las muestras. Al seguir este protocolo, los laboratorios de microbiología pueden llevar a cabo análisis precisos y confiables para detectar la presencia de Bacillus cereus en alimentos, lo que contribuye significativamente a garantizar la seguridad alimentaria y proteger la salud pública. Esta guía proporciona un enfoque sistemático y estandarizado que permite a los profesionales de laboratorio identificar de manera efectiva la presencia de Bacillus cereus, lo que facilita la toma de decisiones relacionadas con la seguridad alimentaria y la prevención de enfermedades transmitidas por alimentos. La implementación de este protocolo también puede ayudar a las autoridades sanitarias y a la industria alimentaria a mantener altos estándares de calidad y seguridad en la cadena alimentaria.
2. Materials and Methods. Antes de ingresar al laboratorio, se asegurarán todas las normas de bioseguridad para garantizar un ambiente de trabajo seguro. Se encenderá el mechero para esterilizar la zona de trabajo y así iniciar el cultivo de Bacillus cereus. La muestra de arroz cocido se pesará a 11 g o ml. Seguidamente, se añadirán 99 ml de agua de peptona a la muestra de arroz cocido, lo que resultará en una dilución de 10-1, que será la primera muestra. De esta muestra diluida (10-1), se tomará 1 ml y se agregará a 9 ml de agua de peptona en un tubo de ensayo, obteniendo así la segunda muestra diluida de 10-2. Al sembrar la primera muestra (dilución 10-1) en una caja de Petri, se marcará adecuadamente, al igual que la segunda muestra (dilución 10-2) en otra caja de Petri, que se marcará correctamente. Posteriormente, se añadirá el agar MYP a cada una de las cajas de Petri que contienen las muestras, se revolverá suavemente y se dejará reposar hasta que el agar se solidifique. Cuidadosamente, se cerrarán las cajas de Petri y se empacarán las muestras en bolsas ziploc, marcándolas con el nombre de cada uno de los integrantes del grupo. Las cajas de Petri se colocarán en una incubadora precalentada a una temperatura de 37-40°C y se incubarán durante 24-48 horas para permitir el crecimiento de Bacillus cereus. Después de la incubación, se observará la presencia de colonias características de Bacillus cereus en las cajas de Petri, lo que indicará el éxito del cultivo y la viabilidad del protocolo implementado. 3. Expected results: Después de la incubación de las muestras por 24-48 horas, en las cajas de Petri sembradas con las muestras de las diluciones 10-1 y 10-2 se esperan resultados específicos que indiquen el crecimiento y desarrollo de Bacillus cereus. En la caja de 32 490 491 492 493 494 495 496 497 498 499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 530 531 532 533 534 535 536 537 538 539
casos se deben al consumo de alimentos contaminados con Salmonella spp., especialmente productos de origen animal, como huevos, carne, leche y derivados (3). La detección de Salmonella spp. en alimentos es de vital importancia para prevenir y controlar las ETA, así como para garantizar la inocuidad y la calidad de los productos alimenticios. Existen diferentes métodos para la determinación de Salmonella spp. en alimentos, que se basan en el cultivo microbiológico, las pruebas bioquímicas, las técnicas moleculares o la combinación de estas (4). Sin embargo, algunos de estos métodos presentan limitaciones, como la falta de sensibilidad, especificidad, rapidez o facilidad de aplicación (5). El objetivo general de este trabajo fue comparar la eficacia de tres métodos para la determinación de Salmonella spp. en alimentos: el método convencional de recuento en placa, el método inmunocromatográfico de detección rápida y el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.
- Materials and methods. Se utilizarán 100 muestras de alimentos de diferentes tipos (huevos, carne, leche, queso y ensalada), que se obtendrán de distintos puntos de venta de la ciudad de Cartagena de Indias, Colombia. Se aplicarán los siguientes métodos para la determinación de Salmonella spp. en cada muestra: se empleará el método convencional de recuento en placa según la norma UNE-EN ISO 6579-1:2017 (6), que consistirá en las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, selección en medios sólidos, identificación bioquímica y serotipificación. También se utilizará el Método inmunocromatográfico de detección rápida según las instrucciones del fabricante del kit comercial Salmonella Rapid Test (Bio-Rad, EE.UU.) (7), que se basa en la detección de antígenos de Salmonella spp. mediante anticuerpos monoclonales conjugados con partículas de oro coloidal; y se empleará el Método de PCR en tiempo real según el protocolo descrito por Malorny et al. (2004) (8), que se basa en la amplificación y detección de un fragmento de 284 pb del gen invA de Salmonella spp. mediante sondas TaqMan específicas. Se compararán los resultados obtenidos con los tres métodos, calculando los parámetros de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y concordancia. Se utilizará el método convencional de recuento en placa como referencia. Se aplicará el análisis estadístico con el programa SPSS versión 25.0, usando el nivel de significancia de 0,05. 3. Results esperados. Se espera encontrar una prevalencia de Salmonella spp en las muestras de alimentos de alrededor del 10%, según los datos reportados por el Instituto Nacional de Salud de Colombia (9). Se espera que el método de PCR en tiempo real sea el más sensible y específico, seguido del método inmunocromatográfico de detección rápida y finalmente del método convencional de recuento en placa. Se espera que el método de PCR en tiempo real sea el más rápido y el método convencional de recuento en placa el más lento. Se espera que los tres métodos tengan una buena concordancia entre sí, con un índice kappa superior a 0,8. 4. Preguntas complementarias. 38 589 590 591 592 593 594 595 596 597 598 599 600 601 602 603 604 605 606 607 608 609 610 611 612 613 614 615 616 617 618 619 620 621 622 623 624 626 627 628 629 630 631 632 633 634 635 636 637 638 639
- ¿Qué factores pueden influir en la contaminación de los alimentos con Salmonella spp?
- ¿Qué medidas de prevención se pueden adoptar para evitar la transmisión de Salmonella spp por los alimentos?
- ¿Qué ventajas y desventajas tiene el uso de métodos moleculares frente a métodos microbiológicos para la determinación de Salmonella spp en alimentos?
- ¿Qué otros microorganismos patógenos se pueden detectar en los alimentos mediante los métodos utilizados en este trabajo?
- ¿Qué implicaciones tiene la serotipificación de Salmonella spp para el diagnóstico, el tratamiento y la epidemiología de las ETA? 5. References.
- CDC. Salmonella. [Internet]. 2020 [citado 29 Feb 2024]. Disponible en: https://www.ins.gov.co/BibliotecaDigital/informe-de-vigilancia-por-laboratorio-salmonella-spp- colombia-1997-2018.pdf
- OMS. Salmonelosis. [Internet]. 2018 [citado 29 Feb 2024]. Disponible en: http://scielo.org.co/scielo.php? script=sci_arttext&pid=S0123-
- FAO/OMS. Salmonella y Campylobacter en carne de pollo. [Internet]. 2019 [citado 29 Feb 2024]. Disponible en: https://bing.com/search?q=informe+cient%c3%adfico+sobre+determinaci %c3%b3n+de+Salmonella+SPP
- Diferentes métodos para aislamiento y detección de Salmonella spp. en alimentos. Revista Científica. 2017; 27(4): 587-599. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/817/Resumenes/Resumen_81730850009_1.pdf
- Redalyc. Aislamiento microbiológico de Salmonella spp. y herramientas moleculares para su identificación. [Internet]. 2016 [citado 29 Feb 2024]. Disponible en: https://www.redalyc.org/journal/776/77658704011/
- UNE-EN ISO 6579-1:2017. Microbiología de la cadena alimentaria. Método horizontal para la detección, enumeración y serotipado de Salmonella. Parte 1: detección de Salmonella spp. [Internet]. 2017 [citado 29 Feb 2024]. Disponible en: https://doi.org/10.25100/iyc.24i1.
- Bio-Rad. Salmonella Rapid Test. [Internet]. 2020 [citado 29 Feb 2024]. Disponible en: https://orcid.org/0000-0001-6028-
- Malorny B, Hoorfar J, Bunge C, Helmuth R. Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR: towards an international standard. Appl Environ Microbiol. 2004; 70(1): 290-296. Disponible en: https://orcid.org/0000-0002-7953-
- INS. Informe de vigilancia por laboratorio de Salmonella spp.: “Colombia 1997-2018”. [Internet]. 2019 [citado 29 Feb 2024]. Disponible en: https://orcid.org/0000-0001-6218- 41 640 641 642 643 644 645 646 647 648 649 650 651 652 653 654 655 656 657 658 659 660 661 662 663 664 665 666 667 668 669 670 671 672 673 674 675 676 677 678 679 680 681 682 683 684
