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Nicolás Alvarado, Comisión 24. 2024 Universidad Nacional del Sur
Informe de laboratorio N°
Proteínas
Objetivos:
Obtener la cantidad de proteínas (en mg) de las fracciones subcelulares (fracción nuclear, mitocondrial y sobrenadante postmitocondrial) a partir del homogenato total de hígado de rata.
Cuantificar el contenido proteico del homogenato total y de las diferentes
fracciones subcelulares, por el método colorimétrico de Biuret.
Determinar el porcentaje de recuperación del protocolo y contribución de cada
fracción.
Resultados:
Siguiendo este protocolo experimental esquemático se separaron las fracciones subcelulares.
Para realizar la curva de calibrado se prepararon varios tubos de ensayo con albúmina sérica bovina (10mg/ml), NaOH 0,4 M y Biuret en distintas proporciones cada uno de ellos, luego se calculó cuantos mg de proteína poseía cada tubo y cuando finalizó la reacción, se midió la absorbancia de estos. Sabemos que cada ml de solución estándar de proteína posee 10 mg de esta, por lo que el cálculo para cada tubo fue el siguiente: En 1 ml de solución__ 10 mg de proteína En 0,5 ml solución (tubo 1)__X= 5,0 mg proteína. De esta forma se completó la siguiente tabla para la curva de calibrado con albúmina sérica bovina: Tubo Solución estándar (10mg/ml) (ml) NaOH 0, M (ml) Biuret (ml) mg albúmina
DO
DO
Corregida (sin Bco) Blanco --- 1,50 6 0 0,056 --- 1 0,50 1,00 6 5 0,213 0, 2 0,70 0,80 6 7 0,184 0, 3 0,90 0,60 6 9 0,321 0, 4 1,20 0,30 6 12 0,417 0, 5 1,50 --- 6 15 0,491 0, Para la curva de calibrado se calculó la concentración en cada tubo de la siguiente forma: Volumen tubo 1= 7,5 ml que contienen 5 mg de proteína; esto es 5 mg /7,5 ml=0,67 mg/ml 4 6 8 10 12 14 16 0
f(x) = 0.0281735159817352 x + 0. curva de calibrado Linear (curva de calibrado) Linear (curva de calibrado) mg albúmina A b s o r b a n c i a Se observa que se cumple la ley de de Lamber-Beer en toda la curva. También se aprecia que hay 4 puntos solamente debido a que el tubo 2 dio valores de absorbancia menores a lo esperado por un error en la preparación (de pipeteo, de enrace, perdida de muestra, etc) por lo que este valor no es tenido en cuenta para la curva de calibrado. Se separaron las muestras de las fracciones y se tomaron alícuotas de estas para hacer una dilución que permita medir su absorbancia sin turbidez en el tubo.
15 ml __1254,3 mg 70 ml __x=5853,4 mg proteína en la FN Siendo 14 g de tejido, serian 5853,4 mg /14g= 418,1 mg/g tejido en la FN Continuando con este mecanismo, los cálculos para la fracción mitocondrial ( FMit ) son los siguientes: (Alícuota 0, 10 ml) 0,324 abs → x= 10,93 mg (Alícuota 0,15 ml) 0,561 abs → x= 19,34 mg Promediamos para una alícuota de 0,10 ml= 0,15 ml __ 19,34 mg 0,10 ml __x=12,89 mg + 10,93 mg= 23,82 mg: 2=11,91 mg en una alícuota de 0,10 ml tomada de un volumen de 5 ml (que son 2,5 ml de solución y 2,5 ml NaOH)= 0,10 ml __11,91 mg 5,0 ml__x=595,5 mg que es la misma cantidad que en 2,5 ml; contenidas en 15 ml= 15 ml__595,5 mg 70 ml__x=2779 mg proteína en la FMit Al ser 14 g de tejido serian= 2779 mg /14g =198,5 mg/g tejido en FMit. Por último los cálculos para el sobrenadante post mitocondrial ( SPMit )= Una aclaración previa es que nuestros resultados de absorbancia dieron valores muy bajos, cercanos al blanco de reactivo, debido a un error desconocido en la preparación (pudiendo ser que quedaron proteínas en las paredes del tubo sin reaccionar, mala técnica al usar el Vortex, perdida de volumen/material en algún paso) por lo que usamos valores de otra mesada. Al ser todas las muestras producto del mismo tejido es posible compartir estos datos. (Alícuota 0,20 ml) 0,114 abs → x=3,49 mg (Alícuota 0,30 ml) 0,181 abs → x=5,86 mg Promediamos para una alícuota de 0,20 ml= 0,30 ml __3,49 mg 0,20 ml __x=3,91 mg + 3,49 mg =7,40 mg: 2= 3,70 mg en una alícuota de 0,20 ml tomada de un volumen de 4 ml (donde 2 ml son de solución y 2 ml de NaOH): 0,20 ml__3,70 mg 4 ml x= 74,0 mg que es la misma cantidad de proteínas en 2 ml, provenientes de un volumen de 11 ml= 2 ml 74,0 mg 11 ml x= 407 mg Que a su vez es la misma cantidad que había en el tubo en 15 ml. Calculamos mg en los 70 ml de HT= 15 ml 407 mg 70 ml __x=1899,3 mg proteínas en el SPMit. Siendo 14 g de tejido, serian= 1899,3 mg /14g = 185 mg/g tejido. Con estos resultados se completó la siguiente tabla. Muestra mg prot. en alícuotas mg prot. totales mg prot/g tejido % de contribución % de recuperación
HT 9,76 13832 988 --
FN 20,9 5853,4 418,1 52,
Fmit 11,91 2779 198,5 24, SPMit 3,70 1899,3 185 23, El porcentaje de contribución se calcula como la cantidad de proteínas en una fracción (en mg/g de tejido) dividido la suma de proteínas presentes en todas las fracciones subcelulares (mg/ g tejido). El porcentaje de recuperación es el cociente entre la suma de proteínas totales presentes en las fracciones subcelulares (mg proteína/ g tejido) y las proteínas presentes en el homogenato total (mg proteína/ g tejido), multiplicado por 100. El resultado de este porcentaje indica un buen grado de recuperación (por encima de 70% es aceptable).
