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Articulo sobre estudios ante el hongo micorrizico arbuscular
Tipo: Monografías, Ensayos
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Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas
Aspirante: Lic. Eduardo J. Pérez Ortega
Tutores: Dra. Annia Hernández Rodríguez Dra. C. Ondina León Sánchez
Pérez-Ortega, E.J. Hongos micorrízicos arbusculares (HMA) para la bioprotección de patógenos en el cultivo del tomate (Solanum lycopersicum L.) [Tesis en opción al grado de Doctor en Ciencias Biológicas] Universidad de La Habana, 2010. 77 p.
Pérez-Ortega, E.J. 2010. Hongos micorrízicos arbusculares (HMA) para la bioprotección de patógenos en el cultivo del tomate (Solanum lycopersicum L.) [Tesis en opción al grado de Doctor en Ciencias Biológicas] Universidad de La Habana. 77 p.
La aplicación de los hongos micorrízicos arbúsculares (HMA) en los sistemas agrícolas sostenibles tiene potencial en la reducción de las afectaciones producidas por patógenos y proveen otros beneficios entre los que se encuentran, incrementos en el crecimiento y productividad de las plantas, mejoras en la nutrición del Fósforo y la tolerancia a la toxicidad de los metales. En este trabajo se seleccionaron cepas de dos géneros de HMA, en base a la ocupación fúngica y la inducción de enzimas de defensa destacándose las cepas Glomus hoi- like y G. mosseae por la rapidez en que inducen estos mecanismos defensivos y por los niveles de ocupación fúngica, transitando en un menor periodo de tiempo de la fase de estrés biótico a simbionte. Se demostró además que estos HMA no son inductores de respuesta sistémica adquirida en el cultivo del tomate, al no encontrarse diferencias significativas en los niveles de activación de los sistemas de defensa entre las plantas micorrizadas y las testigo. Se observaron diferencias entre los aislados seleccionados en cuanto al efecto de bioprotección y la capacidad de aumentar resistencia y tolerancia frente a los patógenos estudiados resultando la cepa G. hoi -like eficaz contra los patógenos foliares Alternaria solani y Oidiopsis taurica , y de raíz, Phytophthora infestans , reduciendo la severidad de los daños provocados por estos patógenos, en las condiciones de sustrato empleadas. No se observaron efectos contra P. nicotianae. La cepa G. mosseae resultó ineficiente contra la mayoría de los patógenos estudiados, aún cuando las condiciones ambientales y de fertilidad del sustrato no difirieron para ambos aislados. Las enzimas estudiadas no están involucradas de forma independiente con la disminución de la severidad observada para los patógenos estudiados, sino que la bioprotección contra estos microorganismos está relacionada con los niveles centinelas de PR proteínas que permite el condicionamiento rápido de la respuesta defensiva en la planta con la consiguiente disminución de la severidad de la enfermedad.
Pág. 1 CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5 1.1 Generalidades del cultivo del tomate 5 1.1.1 Principales enfermedades que afectan al cultivo del tomate en Cuba 5 1.2 Los Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares (HMA) 6 1.2.1 Funcionamiento de la simbiosis planta-HMA 8 1.3 Mecanismos defensivos de las plantas 11 1.3.1 Sistema de inmunidad innata 14 1.3.2 Mecanismos constitutivos 14 1.3.3 Mecanismos inducidos 14 1.3.4 Respuestas de defensa sistémicas 14 1.3.4.1 Proteínas relacionadas con la patogenicidad (PR proteínas) 15 1.4 Características distintivas de la interacción planta hospedante- HMA 16 1.4.1 Elicitores de HMA 16 1.4.2 Amplitud de las respuestas de defensa 17 1.4.3 Mecanismos para el control de la elicitación y las respuestas de defensa en las plantas micorrizadas 19 1.4.3.1 Metabolismo de los fenilpropanoides 20 1.4.3.2 Proteínas relacionadas con la patogénesis e isoformas de enzimas hidrolíticas 20 1.4.4 Cambios en la señalizaión de las vías del ácido jasmónico y el ácido salicílico en plantas micorrizadas 21 1.5 Manejo de los HMA en la agricultura y su contribución a la bioprotección de plantas 22 CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS 25 Material Vegetal 25 Condiciones experimentales 25 2.1 Selección de cepas de hogos micorrízicos arbusculares (HMA) 26 2.1.1 Análisis de a ocupación fúngica 27 2.1.2 Dinámica de inducción de actividad enzimática en raíces de 27
raíces de plantas de tomate inoculadas con diferentes HMA Actividad de la enzima peroxidasa (PRX) 34 Actividad de la enzima polifenoloxidasa (PPO) 35 Actividad de la enzima quitinasa 36 Actividad de la enzima β 1,3 glucanasa 36 Actividad de la enzima fenilalanina amonioliasa (PAL) 37 3.2 Dinámica de inducción temporal y local de PR2 y PR3 en plantas micorrizadas con las cepas promisorias 38 3.3 Estudio de la inducción temporal, local y sistémica de PRs en plantas de tomate inoculadas con las cepas de HMA seleccionadas 39 3.3.1 Dinámica de colonización y ocupación fúngica de las plantas 39 3.3.2 Masa fresca de la raíz y parte aérea de plantas de tomate 41 3.3.3 Dinámica de la inducción de PRs en raíz y hojas 41 3.3.3.1. Dinámica de la inducción de Peroxidasa en raíz y hojas 41 3.3.3.2 Dinámica de la inducción de β 1-3 glucanasa en raíz y hojas 43 3.3.3.3 Dinámica de la inducción de quitinasa en raíces y hojas de plantas de tomates micorrizadas 44 3.4 Efecto de los HMA seleccionados sobre la severidad de las enfermedades causadas por Phytophthora nicotianae , P. infestans , Alternaria solani y Oidiopsis taurica ., en tomate de la variedad Amalia 45 3.4.1 Ocupación fúngica 45 3.4.2 Evaluación de la severidad de los daños producidos por patógenos de la raíz 46 3.4.2.1 Severidad de Phytophtora spp. sobre plantas inoculadas con las cepas de HMA seleccionadas 46 3.4.3 Actividades enzimáticas detectadas en las plantas frente al ataque de los patógenos de raíz 47 3.4.3.1 Actividad PRX en hojas y raíces de plantas inoculadas con HMA frente al ataque de patógenos de raíz 47
3.4.3.2 Actividad PR3 en hojas y raíces de plantas micorrizadas frente al ataque de patógenos 48 3.4.3.3 Actividad PR2 en hojas y raíces de plantas inoculadas con HMA frente al ataque de patógenos 49 3.4.3.4 Actividad PAL en hojas y raíces de plantas inoculadas con HMA frente al ataque de patógenos 50 3.3.5 Análisis de componentes principales en la interacción planta-patógenos de raíz-HMA. 51 3.3.6 Evaluación de la severidad de los daños producidos por los patógenos de acción foliar 53 3.3.6.1 Severidad de las afectaciones producidas por Alternaria solani sobre las plantas inoculadas con HMA 53 3.3.6.2 Afectaciones producidas por Oidiopsis taurica sobre las plantas inoculadas con HMA 54 3.3.7 Actividades enzimáticas detectadas en las plantas frente al ataque de patógenos foliares 54 3.3.7.1 Actividad PRX en hojas y raíces de plantas inoculadas con HMA frente al ataque de patógenos foliares 54 3.3.7.2 Actividad PR3 en hojas y raíces de plantas micorrizadas frente al ataque de patógenos foliares 55 3.3.7.3 Actividad PR2 en hojas y raíces de plantas inoculadas con HMA frente al ataque de los patógenos foliares 56 3.3.7.4 Actividad PAL en hojas y raíces de plantas micorrizadas frente a los patógenos foliares 57 3.3.8 Análisis de componentes principales en la interacción planta-patógenos foliares-HMA 58
CAPÍTULO IV. DISCUSIÓN 60 4.1 Selección de cepas de dos géneros de hongos de micorrízicos arbusculares (HMA) 60 4.2 Dinámica de inducción temporal y local de PR 2 y PR 3, en plantas micorrizadas con las cepas que resultaron las más 65
Por más de 400 millones de años las plantas han establecido una asociación mutualística conocida como micorrizas arbusculares (Pazskowski, 2006). Aproximadamente el 80% de todas las plantas terrestres, incluyendo la mayoría de las de interés agronómico son capaces de establecer esta asociación. El establecimiento de la simbiosis requiere de un programa de desarrollo coordinado que involucra la diferenciación de ambos simbiontes para crear una nueva interfase dentro de las células de la raíz (Harrison, 2005). Aunque las señales moleculares que permiten la comunicación inicial aun son desconocidas, estudios recientes apuntan hacia la existencia de estas (Harrison, 2005). Además, dentro de la planta se inducen señales específicas de la micorrización que influyen sobre el desarrollo de la raíz. Los efectos benéficos de las micorrizas son ampliamente conocidos e incluyen mejoras en la nutrición mineral, e incrementos en la capacidad para superar los estrés bióticos y abióticos a través de una sofisticada red de señales (Fujita et al ., 2006). Entre las vías de señales que se establecen, el sinergismo y antagonismo proveen un potencial regulatorio que permiten la inducción de mecanismos de defensa (Pozo y Azcón-Aguilar, 2007). En el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) se trabaja desde 1992 en la utilización y extensión de estos hongos en la nutrición vegetal en general y en la fosforada en particular, contando con un sistema de recomendación de cepas por tipo de suelo (pH, contenido de materia orgánica y nivel de fertilidad) (Rivera et al. , 2007), de forma tal que el cultivo sea eficientemente micorrizado, así como, en la tolerancia de las plantas micorrizadas al estrés de temperatura y en el mejoramiento de las condiciones hídricas del cultivo (Dell Amico et al ., 2002). La aplicación de los hongos micorrízicos en los sistemas agrícolas ofrece además cierto potencial en la reducción de las afectaciones producidas por patógenos y proveen otros beneficios entre los que se encuentran, mejorar la nutrición fosforada (Paszkowski, 2007) y la tolerancia a la toxicidad de los metales, entre otras (Hildebrandt et al. , 2007). El efecto de bioprotección y la capacidad de aumentar resistencia o tolerancia, difiere entre especies de HMA, pues no todas son efectivas frente a los diferentes patógenos, comportamiento que está modulado por las condiciones ambientales (Azcón-Aguilar y Barea, 1996; Whipps, 2004; Pozo y Azcón-Aguilar, 2007). Entre las causas que afectan los rendimientos del cultivo del tomate ( Solanum lycopersicon ) se encuentran los daños ocasionados por plagas, de las cuales, los producidos por especies de Alternaria, Phytophtora y Oidium se consideran de gran importancia para el mismo.
Las enfermedades producidas por Alternaria sp. en solanáceas son de distribución mundial y la importancia del hongo está dada por ser factor limitante en la producción de papa ( Solanum tuberosum ) y tomate, en las condiciones de elevada humedad de los trópicos. Alternaria solani produce en tomate la podredumbre del cuello y el tizón temprano, que causa defoliación de plantas maduras y por tanto las mayores pérdidas de productividad (Castaño-Zacata y del Río, 1994; Plagas y enfermedades del tomate, 2006). Las semillas procedentes de frutos infectados pueden transmitir la enfermedad a las plántulas, provocando el chancro del hipocotilo (Dillard et al ., 1994; Agrios, 2005). Todas estas alteraciones provocan la disminución del rendimiento o la reducción de la calidad de los cultivos (Agrios, 2004). Las algas del género Phytophthora son típicas habitantes del suelo y causan una variedad de enfermedades en diferentes tipos de cultivos, desde anuales y ornamentales, hasta cultivos perennes. La mayoría de las especies causan pudrición de las raíces, las plántulas, tallos y tubérculos similares a los causados por Pythium sp. Todos estos síntomas aparecen en cualquier región donde el suelo sea lo suficientemente húmedo como para que el microorganismo pueda crecer. En las plantas infectadas, el primer síntoma que se manifiesta es la desnutrición, por lo que se debilitan rápidamente y se vuelven susceptibles al ataque de otros patógenos. La cenicilla polvorienta es una enfermedad causada por varios agentes entre los que se encuentra la especie Oidium taurica que produce desecación, necrosis de la hojas y tallos, con la consecuente defoliación de las plantas y pérdida de la productividad de los cultivos (Plagas y enfermedades del tomate, 2006). En los últimos años, la incidencia de Alternaria sp.y Oidium sp. se incrementó en Cuba, motivado por inviernos húmedos con temperaturas más altas, debido al efecto del Cambio Climático ( Pérez, 2003; Martínez et al., 2006; Gómez, 2008). El excesivo uso de insumos químicos para controlar enfermedades es un problema importante en los sistemas de producción actuales (Cordier et al., 1998), por lo que se priorizan alternativas de investigación que favorezcan las prácticas de manejo, compatibles con el medio ambiente y una agricultura sostenible. Estos incluyen el uso de microorganismos beneficiosos tales como, los hongos micorrízicos arbusculares que contribuyen a la reducción de las enfermedades de la raíz producidas por un número de patógenos del suelo (Barea et al ., 2005). Durante la evolución, las plantas han desarrollado estrategias que les permiten reconocer a los patógenos que las invaden y desencadenar una defensa exitosa (Staskawicz et al ., 2001). Esta respuesta se induce después del reconocimiento de los patrones moleculares asociados a patógenos e incluye proteínas, péptidos, carbohidratos y lípidos (Zipfel y Felix, 2005). Entre estas proteínas, las relacionadas con la patogenicidad (PR proteínas) son de gran importancia pues constituyen una barrera defensiva contra el ataque de patógenos y se inducen no solo por la infección con varios
Objetivo general: Demostrar que la inducción de mecanismos de defensa locales y sistémicos mediados por la colonización de hongos micorrízicos, contribuye a la bioprotección de las plantas de tomate variedad Amalia.
Objetivos específicos:
Novedad Científica : Se realizan aportes al conocimiento en aspectos relacionados con la dinámica de inducción de mecanismos de defensa en plantas inoculadas con diferentes especies de hongos micorrizógenos arbusculares, demostrándose por primera vez que en la interacción tomate-HMA no se inducen respuestas sistémicas. Se demuestra que la cepa G. fasciculatum tiene efecto bioprotector contra el ataque de patógenos foliares y de raíz en el cultivo del tomate, reportándose por primera vez su efecto contra O. taurica. Se demuestra por primera vez para la ciencia que existe una relación entre las dinámicas de ocupación fúngica y de inducción de mecanismos de defensa por los HMA, lo que podría ser utilizado como marcador bioquímico en el estudio de las interacciones planta-HMA.
Importancia teórica : Este trabajo contribuye al esclarecimiento de la relación que existe entre la colonización micorrízica de plantas de tomate de la variedad Amalia y la inducción de mecanismos defensivos. Otro aporte teórico lo constituye la demostración de que existen diferencias entre cepas de HMA eficientes en la bioprotección de enfermedades que afectan diferentes tejidos de las plantas de tomate ( S. lycopersicon , L.) variedad Amalia, en la condición de suelo donde se desarrolla la micorrización eficiente.
Importancia práctica : Se demostró la diferenciación de cepas de HMA, que se asocian con similar intensidad, en la bioprotección del cultivo del tomate contra el ataque de patógenos que afectan diferentes tejidos de la planta, que podrían ser aplicadas en ecosistemas agrícolas sostenibles con vistas a disminuir el uso de pesticidas químicos y evitar el deterioro ambiental.
1.1 Generalidades del cultivo del tomate
El cultivo del tomate ( Solanum lycopersicon L.) requiere para su crecimiento temperaturas entre 10 y
26ºC, humedad relativa baja y alta luminosidad. Se siembra preferentemente en suelos franco-
arenosos, retentivos, con buen drenaje y alto contenido de materia orgánica, profundos y con pH entre
5,8 y 6,5. Se encuentra entre las hortalizas de mayor consumo a nivel mundial con una producción
anual de más de 92,9 millones de toneladas (FAOSTAT, 2008). La extensión de su cultivo responde a
una demanda creciente, derivada de su papel fundamental en los hábitos alimentarios de un amplio
sector de la población.
En Cuba, constituye la hortaliza principal, tanto por el área que ocupa como por su producción. El
tomate comprende el 50% del total de áreas dedicadas al cultivo de las hortalizas y anualmente se
siembran más de 63 000 hectáreas. La producción anual alcanza 802 600 toneladas (FAOSTAT,
2008).
1.1.1 Principales enfermedades que afectan al cultivo del tomate en Cuba
El tomate es afectado por numerosos patógenos que causan pérdidas elevadas en su producción. Entre
estos se destacan las enfermedades producidas por Alternaria solani , este produce la pudrición del
cuello en tomate y el tizón temprano, que provocan defoliación de plantas maduras y por tanto las
mayores pérdidas de productividad. Las semillas procedentes de frutos infectados pueden transmitir la
enfermedad, provocando el chancro del hipocotilo (Agrios, 2005).
El género Phytophthora puede causar enfermedades multicíclicas en raíces y hojas, dado por su alta
velocidad de producción de zoosporas. Bajo condiciones óptimas, el inóculo de estas especies puede
pasar de escaso a altas concentraciones en pocos días o semanas. La mayoría de las especies causan
pudrición de las raíces, plántulas, tallos y tubérculos, similares a los causados por Pythium sp. Entre
las pérdidas provocadas por este género se informan, disminución del rendimiento de hasta el 40% en
Los HMA existen en el suelo como esporas y germinan independientemente de la presencia de una planta, la hifa germinada crece a través del suelo en busca de una raíz hospedante. Una vez establecido el contacto entre los simbiontes, el hongo forma un apresorio en la superficie de la raíz. Los patrones de crecimiento dentro de la raíz varían en dependencia de la especie involucrada, en dos tipos morfológicos denominados Paris y Arum, en dependencia de la especie de planta en la que fueron observados por primera vez, en la práctica esta división no es muy clara (Smith y Smith, 1997; Cavagnaro et al., 2001).
La germinación de una espora individual hasta la formación de una red de hifas, involucra una
secuencia de eventos morfogenéticos representados por la germinación de esporas y crecimiento micelial presimbiótico, patrones de ramificación diferencial de la hifa en presencia de raíces hospedantes, formación del apresorio, colonización radical, desarrollo del arbúsculo, crecimiento micelial extrarradical y producción de esporas (Harrison, 2005). Después de la germinación, el tubo germinativo hifal crece a través del suelo. En ausencia de un potencial hospedante (fase asimbiótica), el crecimiento hifal está limitado por las bajas cantidades de carbono almacenadas (Bago et al, 2000) y eventualmente cesa. Sin embargo, la espora retiene suficiente fuente carbonada para repetir la fase germinativa más tarde y encontrar un hospedante
División Glomeromycota Clase Glomeromycetes Familia Género
Órdenes
Glomerales Glomeraceae Glomus Diversisporales Gigasporaceae Gigaspora & Scutellospora Acaulosporaceae Acaulospora, Kuklospora & Appendicispora Entrophosporaceae Entrophospora Pacisporaceae Pacispora Diversisporaceae Diversispora & Otospora Paraglomerales Paraglomeraceae Paraglomus Archaeosporales Geosiphonaceae Geosiphon Archaeosporaceae Archaeospora & Intraspora Ambisporaceae Ambispora
apropiado. Las esporas particularmente grandes de Gigaspora gigantea pueden germinar hasta 10 veces (Koske, 1981). Para ambos simbiontes, el período anterior al contacto físico (formación del apresorio) involucra el reconocimiento y la atracción de ambas partes, así como otros eventos que promueven la alianza (Paszkowski, 2006). La sobrevivencia de los hongos biotróficos está realzada por la germinación “económica” y la rápida colonización de la planta hospedante. Los exudados de la raíz promueven o suprimen la germinación de las esporas, lo que indica la presencia de receptores responsables para las alteraciones en la composición química del ambiente (Bécard et al. , 2004; Harrison, 2005). En la vecindad de una raíz hospedante, se induce crecimiento hifal y aumenta la ramificación de esta (Buee et al. , 2000). Esta respuesta puede ser activada por los exudados de una raíz hospedante, pero nunca por exposición a una raíz no hospedante o sus exudados (Paszkowski, 2006).
1.2.1. Funcionamiento de la simbiosis planta-HMA
La simbiosis planta-HMA se rige fundamentalmente por los genomas de ambos simbiontes y está influenciada a su vez por el medio ambiente (Koide et al ., 2004; Harrison 2005; Paszkowski, 2006). En la penetración y distribución del hongo en las raíces ocurren modificaciones fisiológicas tales como: incremento de la actividad nuclear, de la masa citoplasmática, del grado de vacuolización de las células corticales, de la diferenciación de los tejidos vasculares, de la tasa fotosintética y de la síntesis de proteínas, clorofila, sustancias de crecimiento y metabolitos secundario; generación de nuevos organelos y activación de los sistemas enzimáticos. Se favorece, además, la absorción y traslocación de nutrientes y agua. A pesar del arreglo de la planta y la especie de HMA involucrada, el desarrollo del proceso simbiótico, al menos a nivel morfológico, tiene similitudes. La interacción está acompañada por la alteración en la morfología de ambos simbiontes para crear una nueva interfase simbiótica de la micorriza arbuscular, a través de la que se intercambian los fosfatos y la fuente carbonada (Harrison, 2005).
