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GUIA PRÁCTICA BIOLOGÍA MOLECULAR PCR, Apuntes de Biología Molecular

GUIA PRÁCTICA BIOLOGÍA MOLECULAR PCR

Tipo: Apuntes

2022/2023

Subido el 12/06/2025

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Universidad de Nariño
MANUAL DE BIOLOGÍA MOLECULAR PROCEDIMIENTOS BÁSICOS
Edith Mariela Burbano Rosero-Bianca Caetano de Almeida-Iván Darío Otero Ramírez-Sandra Lorena Álvarez
52
CAPITULO IV
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
4.1 REACCIÓN DE PCR
Como la hibridación de ácidos nucleicos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también
permite detectar una secuencia específica de ADN dentro del panorama de un genoma complejo.
La PCR es básicamente una reacción de duplicación de ADN realizada en un tubo de ensayo para la
amplificación selectiva de una secuencia blanco. Para ello se emplean pares de secuencias cortas de
ADN de cadena simple (oligonucleótidos) con cerca de 20 a 30 bases, que flanquean la secuencia
blanco y sirven como punto de anclaje para que la DNA polimerasa pueda continuar con la
reacción. Los cebadores delimitan la región que se va a amplificar, el cebador
forward
es
complementario a la secuencia localizada en el comienzo de la secuencia blanco y el cebador
reverse
es complementario a la secuencia final (Figura 10). El ADN blanco es adicionado a una
solución tamponada conteniendo DNA polimerasa termo - resistente, cebadores,
desoxirribonucleótidos (dNTPs) y MgCl2. Finalmente, la mezcla es sometida a un programa
amplificación en el termociclador.
Componentes de la reacción
Desoxinucleótidos trifosfato: Los cuatro dNTPs son requeridos en exceso como sustratos para la
síntesis de millones de copias de ADN que se generan al finalizar el programa de termociclado.
Usualmente se usan en concentración de 50 a 200 µM. Para ser reconocidos por la polimerasa
deben ir acompañados de cationes Mg+2, los cuales actúan como cofactores enzimáticos.
Cebadores, oligonucleótidos o primers: La selección de los cebadores para cualquier PCR es de
vital importancia, los cebadores deben ser altamente específicos, es decir que solo hibriden en una
única región de interés. Si un primer tiene 10 bases, la probabilidad que exista una secuencia al azar
con la cual hibride es de (1/4)10, cerca de un millón. En el genoma humano haploide existen
aproximadamente 3 mil millones de pares de bases, lo que haría que esos cebadores hibriden a 3
mil sitios. En cambio, un cebador con 16 bases o más hibridará a un sitio único. Estas estimativas
son realizadas imaginando que el genoma tenga secuencias aleatorias de bases, lo que en verdad
no es cercano a la realidad, pero sirve como un estimativo preliminar.
Los cebadores deben cumplir con algunos requerimientos tales como, tener entre ellos una
temperatura de fusión (Tm) igual o parecida, de manera que se puedan anillar o hibridar a la
secuencia diana a la misma temperatura. Una de las fórmulas más sencillas para calcular la Tm de
los cebadores es:
Tm= 2(AT) + 4(GC)
Los cebadores se hibridan al ADN molde en temperaturas entre 50 ºC a 65 ºC, tres variables
determinan la temperatura ideal y el tiempo necesario para que ocurra la hibridación: concentración
de los cebadores, longitud de los cebadores y la secuencia de bases de los cebadores.
Generalmente la temperatura de hibridación es cerca de 5 oC abajo de la Tm de los cebadores,
donde Tm (Temperatura melting) es definida como la temperatura en que 50% de las moléculas de
cadena doble del ADN están desnaturalizadas. La Tm de un cebador puede ser estimada
atribuyéndose 4 °C para cada G o C, y 2 °C para cada A o T. Si es necesario, la temperatura óptima
de hibridación puede ser determinada experimentalmente.
Igualmente, los cebadores deben tener un contenido de GC de alrededor de 50 %, no poseer
regiones ricas de pirimidinas y purinas, no deben ser complementarios entre sí y se deben evitar
secuencias con presencia de estructuras secundarias significativas. Por lo general, los cebadores se
utilizan en una concentración de 0.1 a 0.5 µM.
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CAPITULO IV

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

4.1 REACCIÓN DE PCR

Como la hibridación de ácidos nucleicos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también permite detectar una secuencia específica de ADN dentro del panorama de un genoma complejo. La PCR es básicamente una reacción de duplicación de ADN realizada en un tubo de ensayo para la amplificación selectiva de una secuencia blanco. Para ello se emplean pares de secuencias cortas de ADN de cadena simple (oligonucleótidos) con cerca de 20 a 30 bases, que flanquean la secuencia blanco y sirven como punto de anclaje para que la DNA polimerasa pueda continuar con la

reacción. Los cebadores delimitan la región que se va a amplificar, el cebador forward es

complementario a la secuencia localizada en el comienzo de la secuencia blanco y el cebador

reverse es complementario a la secuencia final (Figura 10 ). El ADN blanco es adicionado a una

solución tamponada conteniendo DNA polimerasa termo - resistente, cebadores, desoxirribonucleótidos (dNTPs) y MgCl 2. Finalmente, la mezcla es sometida a un programa amplificación en el termociclador. Componentes de la reacción Desoxinucleótidos trifosfato: Los cuatro dNTPs son requeridos en exceso como sustratos para la síntesis de millones de copias de ADN que se generan al finalizar el programa de termociclado. Usualmente se usan en concentración de 50 a 200 μM. Para ser reconocidos por la polimerasa deben ir acompañados de cationes Mg+2, los cuales actúan como cofactores enzimáticos. Cebadores, oligonucleótidos o primers: La selección de los cebadores para cualquier PCR es de vital importancia, los cebadores deben ser altamente específicos, es decir que solo hibriden en una única región de interés. Si un primer tiene 10 bases, la probabilidad que exista una secuencia al azar con la cual hibride es de (1/4)^10 , cerca de un millón. En el genoma humano haploide existen aproximadamente 3 mil millones de pares de bases, lo que haría que esos cebadores hibriden a 3 mil sitios. En cambio, un cebador con 16 bases o más hibridará a un sitio único. Estas estimativas son realizadas imaginando que el genoma tenga secuencias aleatorias de bases, lo que en verdad no es cercano a la realidad, pero sirve como un estimativo preliminar. Los cebadores deben cumplir con algunos requerimientos tales como, tener entre ellos una temperatura de fusión (Tm) igual o parecida, de manera que se puedan anillar o hibridar a la secuencia diana a la misma temperatura. Una de las fórmulas más sencillas para calcular la Tm de los cebadores es:

Tm= 2(AT) + 4(GC)

Los cebadores se hibridan al ADN molde en temperaturas entre 50 ºC a 65 ºC, tres variables determinan la temperatura ideal y el tiempo necesario para que ocurra la hibridación: concentración de los cebadores, longitud de los cebadores y la secuencia de bases de los cebadores. Generalmente la temperatura de hibridación es cerca de 5 oC abajo de la Tm de los cebadores, donde Tm (Temperatura melting) es definida como la temperatura en que 50% de las moléculas de cadena doble del ADN están desnaturalizadas. La Tm de un cebador puede ser estimada atribuyéndose 4 °C para cada G o C, y 2 °C para cada A o T. Si es necesario, la temperatura óptima de hibridación puede ser determinada experimentalmente. Igualmente, los cebadores deben tener un contenido de GC de alrededor de 50 %, no poseer regiones ricas de pirimidinas y purinas, no deben ser complementarios entre sí y se deben evitar secuencias con presencia de estructuras secundarias significativas. Por lo general, los cebadores se utilizan en una concentración de 0.1 a 0.5 μM.

Reconstitución de cebadores Los cebadores pueden ser resuspendidos en agua grado molecular o tampón TE estéril, seguido por lo menos de 2 minutos de agitación cuidadosa con micropipeta y se deben guardar a - 20 °C. http://functionalbio.com/web/dilution_resuspension_input.php Tener en cuenta las siguientes fórmulas para la determinación de volumen de TE o agua ultrapura a adicionar: Cuando llega un primer de una casa comercial, viene una información relacionada con la concentración, entonces, esta concentración en nanomoles debe ser multiplicada por 10 para obtener la cantidad de microlitros en que debe resuspenderse el primer, de esta forma, se tiene una concentración stock de 100 μM. Ejemplo: Si un primer llega a la concentración de 96 nM, entonces→ 96 x10 = 960 μL de TE o agua ultrapura que deben ser usadas para reconstituir el primer y dejar la solución a 100 μM. La solución de trabajo en la gran mayoría de PCR es recomendable estar a una concentración de 20 μM, entonces se hace una dilución 1/5.

Conversión de pmoles del cebador a μg =pmoles (longitud x 325) / 1000000

Conversión de μg de cebador en pmoles=μg x 1000000/ (longitud x 325)

10 pmoles de un cebador de 25 mer = (10 x 25 x 325) / 1000000= 0.081 μg de primer

ADN polimerasa termoestable: Comúnmente se emplea la Taq polimerasa, originalmente

aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus. Es una enzima activa a altas temperaturas (75 oC)

y estable con frecuencia hasta 95 oC. Esta característica permite su actuación en sucesivos ciclos de replicación (amplificación) sin inactivarse. Además, la replicación a temperaturas elevadas impide la formación de híbridos parcialmente desapareados y contribuye a la especificidad y rendimiento del proceso. La enzima normalmente se utiliza a una concentración de 1 U/ 50 μL de reacción. Tampón o buffer: El amortiguador estándar para PCR contiene 5 0 mM de KCl para facilitar la hibridación (una concentración mayor a 50 mM de KCl podría afectar la DNA polimerasa), 10 mM Tris-HCl (pH=8.3) y 1.5 mM MgCl 2 , el cual actúa como cofactor para la enzima. Molde o ADN blanco: Es la secuencia de ácido nucleico que se desea amplificar. Tanto la calidad como la cantidad de ADN son parámetros críticos. La presencia de sustancias como grupos hemo, urea, etanol y SDS pueden inhibir la acción de la Taq polimerasa. Etapas del proceso

  1. Desnaturalización: Calentamiento para la separación de las cadenas de ADN, la mezcla es llevada por el termociclador a temperatura de 95 oC. Esta temperatura debe ser mayor a la Tm de los cebadores (Figura 10).
  2. Anillamiento: Hibridación de los cebadores a las hebras de cadena sencilla de la secuencia blanco. Generalmente se usan temperaturas de 37 a 65 oC, durante 10 a 120 segundos.
  3. Elongación o extensión: Etapa de amplificación propiamente dicha, en la que la DNA polimerasa elonga los cebadores empleando como molde ambas hebras originales de la secuencia diana de ADN. La extensión transcurre en sentido 5'→ 3’ a partir del extremo 3' OH de cada cebador, empleando como sustrato los cuatro dNTPs hasta terminar la lectura del molde o hasta que se comience una nueva etapa de desnaturalización (siguiente ciclo).

Consideraciones importantes y contaminaciones de la PCR La técnica de PCR es una técnica extremadamente sensible, capaz de detectar la presencia y amplificar una única molécula de ADN. Por eso, es fundamental obedecer rutinas de laboratorio rigurosas para evitar contaminaciones con otras muestras o con un producto de la amplificación de las reacciones previas. Lo ideal es realizar los experimentos de PCR en un sitio exclusivo y la corrida electroforética en otro sitio. Los manipuladores deben utilizar siempre guantes de nitrilo libres de talco y de ser posible usar puntas especiales con filtro que bloquean la contaminación con los aerosoles originados en las muestras pipeteadas. Asociaciones no específicas entre los cebadores pueden acontecer inmediatamente después de la adición de cloruro de magnesio, de modo que el equipo ya debe estar previamente programado y todos los estudiantes deben terminar de preparar la reacción simultáneamente. Trabaje rápidamente e inicie los ciclos de temperatura después de terminar de adicionar todos los reactivos. Para realizar una PCR se debe usar material nuevo y estéril. Los reactivos deben ser descongelados con mucho cuidado. El agua ultrapura debe ser desionizada, autoclavada y posteriormente filtrada a través de membrana de 0.22 μm. Mantener la Taq polimerasa en congelación o baño de hielo durante su uso, para evitar pérdida de actividad de esta enzima.

Use un Lápiz marcador (de preferencia sharpie) para identificar la tapa de cada tubo.

Si hay evaporación en el termociclador, adicione 10 μL de aceite mineral estéril grado molecular a cada tubo de PCR, después de la adición de los reactivos. Objetivo General Amplificar DNA por PCR de forma siguiendo los lineamientos de la guía de laboratorio. Objetivos específicos Conocer la metodología básica para amplificar un blanco de interés por medio de la reacción en cadena de la polimerasa. Reconocer la importancia de las diferentes etapas de la PCR y sus implicaciones de incorrectas manipulaciones en laboratorio. Materiales Centrifuga Termociclador Cámara de electroforesis Fuente de poder Fotodocumentador o transiluminador Micropipetas de diversos volumenes Hielo picado o cajitas refrigerantes Puntas nuevas y estériles de diferentes volumenes Tubos eppendorf Reactivos: tampón TE 1X, tampón TAE 1X, azul de bromofenol, bromuro de etidio u otro agente como SyGreen o EZvision, si se dispone de ellos en el laboratorio. Marcador de tamaño molecular 1 Kb de Promega Mix para PCR: Buffer, Taq-polimerasa, MgCl 2 , dNTPs, cebadores 27F y 1041R, DNA de la muestra ajustado a 100 ng/uL Agua grado molecular filtrada Desinfectante: alcohol 70 % o hipoclorito diluido Máscara y gorro de protección

Guantes de nitrilo Frascos de descarte Libreta de notas

Lápiz marcador (de preferencia sharpie)

Jabón antibacterial Papel toalla Protocolo de preparación de PCR

  1. Descongelar por completo los reactivos en hielo y mezclar por inversión antes de su uso.
  2. Limpiar con solución de hipoclorito de sodio diluido o alcohol a 70 % la superficie de trabajo.
  3. Preparar la reacción de la PCR según las condiciones indicadas en la Tabla 3 , teniendo en cuenta que la pre-mezcla o reacción con todos los componentes (a excepción del ADN blanco), se debe preparar en un área dispuesta sólo para este fin. Adicionalmente, la bata de laboratorio, gorro y guantes deben ser mantenidos en el área.
  4. Los elementos de PCR deben ser almacenados separados de los demás elementos de laboratorio y sólo se destapan en el cuarto de pre-PCR.
  5. Para realizar la amplificación de la sub-unidad ribosomal 16S se utilizarán los cebadores 27F

(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG - Lane, 1991) y 1041R (CGGTGTGTACAAGACCC - Nubel et al.,

1996). Inicialmente estos cebadores se diluirán en agua miliq (ultrapura) formando una solución stock de cada primer a una concentración de 100 μM, a partir de esta, se preparará la solución de trabajo a 20 μM. Por otra parte, se realizará un mix de dNTPs a una concentración de 25mM, a partir del cual se hará un mix de trabajo de dNTPs a una concentración de 2,5 mM.

  1. Se debe calcular las cantidades de cada uno de los componentes de la reacción para obtener el mix, por ejemplo, si son 10 muestras (2 de ellas deben ser el control positivo y negativo de la reacción), entonces se deben usar las cantidades de la columna 10X (Tabla 3), comenzando con los volumenes mayores hasta los menores, entonces primero se adiciona agua (327.5 μL) a un tubo eppendorf, luego, buffer colorless 5X (100 μL), Solución de MgCl 2 25 mM (20 μL), DNTP 2.5 mM (10 μL), cebador (27F), cebador 1041R y GoTaq de Promega (2.5 μL), mezclar con cuidado con la punta de la micropipeta y luego distribuir 48 μL en diez sendos tubos de PCR de 0.2 μL. Adicionar el agua al control negativo en el cuarto de pre- PCR, no volver a abrir este tubo, hasta después del termociclado y verificación del producto en el gel de agarosa.
  2. Salir del área donde se realizó la mezcla y proceder a adicionar 2 μL de la respectiva muestra de DNA para cada uno de los tubos de reacción. Tener en cuenta usar una micropipeta con puntas de filtro y exclusiva para éste fin. Tabla 3. Listado de reactivos y sus cantidades respectivas para la preparación de la PCR para amplificación del gen 16sRNAr Reactivo 1X μL 10X μL Agua ultrapura estéril 32.75 327. Buffer Colorless 5X 10 100 Solución de MgCl 2 25 mM 2 20 dNTP (10 mM de cada), es lo mismo que mix de dNTPs a (2.5 mM)

Cebador 27F (F) 20 μM 1 10 Cebador 1041R (R) 20 μM 1 10 GoTaq Promega 0.25 2. ADN de la muestra (100 ng/μL) 2 μL para cada tubo