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CURSO: BIOQUIMICA
PRÁCTICA N° 1
USO DEL POTENCIÓMETRO Y PREPARACIÓN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
I. INTRODUCCIÓN
En los organismos vivos, se producen continuamente protones e hidroxilos como resultado de las
reacciones metabólicas y es necesario mantener el pH de los fluidos intracelulares y extracelulares,
pues un cambio ocasionaría trastornos en la actividad biológica. El organismo mantiene el pH en
los niveles compatibles con la vida haciendo uso de los tampones fisiológicos (solución buffer o
amortiguadora) y la eliminación de ácidos y bases por compensación respiratoria y renal.
Los buffers, tampones o soluciones amortiguadoras son sustancias o mezclas homogéneas
encargadas de impedir cambios bruscos en el pH. Estas soluciones están formadas por un ácido
débil y su base conjugada ó una base débil y su ácido conjugado. Basado en la teoría de Bronsted
y Lowry, un ácido débil es un donador de protones muy limitado y se caracteriza por ligarse con
mucha fuerza al protón potencial lo que significa que su capacidad de disociación es parcial.
El poder amortiguador de las soluciones tampón es una expresión de dos reacciones
fundamentales y reversibles que se establecen en el equilibrio.
Ecuación de Henderson-Hasselbach
Es una ecuación empleada para el cálculo teórico del pH de sistemas amortiguadores o buffers,
esta ecuación fue derivada de la ley de acción de masas de Guldberg y Waage, y de la aplicación
de conceptos relativos a constantes de equilibrio y ionización de ácidos débiles y bases débiles.
𝑝𝐻 = 𝑝𝑘𝑎 + log
[𝑏𝑎𝑠𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑑𝑎]
[á𝑐𝑖𝑑𝑜]
La capacidad o eficiencia de un amortiguador está basada en dos factores:
- La concentración del sistema amortiguador la misma que corresponde a la suma de las
concentraciones del ácido débil y su base conjugada.
[
]
[
á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒𝑏𝑖𝑙
]
+ [𝑏𝑎𝑠𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑑𝑎]
- La relación que existe entre la concentración de la base conjugada y la del ácido no disociado
o ácido débil. Si dicha relación es 1 o cercano a ese valor entonces el valor de pH es igual al
pKa y la capacidad amortiguadora es máxima.
II. OBJETIVOS:
- Conocer el fundamento y manejo del potenciómetro
- Aprender a preparar soluciones tampón valiéndose de la ecuación de Henderson-
Hasselbach.
- Comparar el pH práctico obtenido de los tampones preparados, con el pH teórico calculado
con la ecuación de Henderson-Hasselbach.
- Comprobar experimentalmente la eficiencia de una solución tampón para resistir cambios
de pH, por la adición de ácidos o bases.
CURSO: BIOQUIMICA
III. MATERIALES Y REACTIVOS:
Potenciómetro.
Calculadora científica (cada alumno).
Solución de lugol al 0.1%.
Vasos de 100 y 250 mL.
Pipetas 2.5 y 10 mL.
Buretas de 25 mL.
Fosfato acido de potasio 0.1 M (K 2
HPO
4
0.1M).
Fosfato diácido de potasio 0.1M (KH 2
P
4
0.1M).
HCl 0.1 N.
NaOH 0.1 N.
Tampón fosfato de pH 7.2 (ya
preparado).
Indicador de fenolftaleína.
Indicador azul de bromofenol.
CURSO: BIOQUIMICA
Determinar potenciométricamente el pH de cada preparación y calcular mediante la
ecuación de Henderson-Hasselbach, el pH teórico de cada una.
Comparar los resultados. Calcular la diferencia entre el pH teórico y práctico en cada caso.
Discutir y concluir.
pKa buffer fosfato: 6.
Reactivos
Vaso N°
(mL)
K
2
HPO
4
0.1M
KH
2
PO
4
0.1M
pH teórico
pH práctico
Diferencia
C. CAPACIDAD AMORTIGUADORA DEL TAMPON FOSFATO
En un vaso de precipitado “A” colocar 10 mL de agua destilada y 02 gotas de azul de
bromofenol. En otro vaso “B”, colocar 10 mL de tampón fosfato de pH 7.2 y 02 gotas del
mismo indicador.
Titular A y B con HCl 0.1 N. Anotar gastos y sacar conclusiones.
En un vaso de precipitado “C”, colocar 10 mL de agua destilada y 02 gotas de fenolftaleína.
En otro vaso “D” colocar 10 mL de tampón fosfato de pH 7.2 y 02 gotas de mismo indicador.
Titular C y D con NaOH 0.1 N. Anotar gastos y sacar conclusiones.
V. CUESTIONARIO
- ¿Qué son los buffers y que función cumple?
- ¿Por qué el vaso A utilizó menos NaOH que el vaso B?
VI. BIBLIOGRAFIA:
Villavivencio, M. 2006. Bioquímica. CONCYTEC. Perú.
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PRACTICA N° 2
ENZIMAS: CATALIZADORES BIOLÓGICOS
Las enzimas son proteínas catalizadoras, es decir que disminuyen la energía de activación de las
reacciones químicas que ocurren en la célula. Una de las características más distintivas de las
enzimas es su alta especificidad. Durante el proceso de catálisis, las enzimas forman un complejo
intermedio con el sustrato en una reacción reversible y luego, se produce la reacción dando lugar
al producto y la enzima permanece activa para una nueva reacción. El estudio de las enzimas
requiere de su aislamiento de las células, purificación, cuantificación de su actividad y los factores
que afectan su actividad como temperatura, pH, inhibidores, etc.
La enzima peroxidasa tiene como función de catalizar la reacción de descomposición del peróxido
de hidrogeno en agua y oxígeno.
I. OBJETIVO
a. Determinar la actividad enzimática de la enzima peroxidasa en tejido vegetal.
b. Evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
II. MATERIALES
Papa.
Licuadora.
Espectrofotómetro.
Baño maría.
Refrigeradora.
Cuchillo.
Beakers de 250 mL.
Tocuyo.
Tubos de prueba de 15 mL.
Pipetas de 1 mL y 5 mL.
Solución de Guayacol 25 mM.
Peróxido de hidrogeno 10 mM.
Tampón fosfato, pH 5.
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- Calibre el espectrofotómetro con el tubo 1.
- Transfiera la mezcla a una cubeta para la lectura en el equipo. Coloque la cubeta
dentro del equipo y mida los cambios de absorbancia a intervalos de 20 segundos
hasta completar 2 minutos. Realice este paso con cada una de las mezclas.
- Grafique sus resultados como absorbancia (eje y) vs tiempo (eje x) para las
temperaturas.
- Determine la actividad enzimática, calculando el ∆ Absorbancia /minuto x g x peso
fresco.
IV. RESULTADOS
- Identifique la temperatura óptima de la enzima.
- Grafique sus resultados como absorbancia (eje y) vs tiempo (eje x).
- Determinar la actividad enzimática, calculando el ∆ Absorbancia /minuto x g x peso
fresco.
V. DISCUSIÓN
Discuta los resultados obtenidos de acuerdo a la bibliografía consultada.
VI. CONCLUSIONES
VII. CUESTIONARIO
- ¿La actividad enzimática varia con la temperatura? Fundamente su respuesta.
- Describa el funcionamiento de la enzima peroxidasa y catalasa en los tejidos
vegetales.
- ¿Cómo afecta la temperatura a la actividad enzimática? ¿Cómo lo observó en el
laboratorio? Fundamente su respuesta.
- Cuando Ud. corta una manzana o un plátano, la enzima feniloxidasa actúa,
observando una coloración parda en la zona afectada. Frecuentemente, se agrega
jugo de limón para evitar este fenómeno. ¿Por qué?
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PRACTICA N° 3
EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL GLUCÓGENO HEPÁTICO
I. INTRODUCCIÓN
Los carbohidratos son de importancia fundamental en la biosfera y se elaboran durante la
fotosíntesis. Por fotosíntesis, las plantas verdes, algas y ciertas bacterias pueden usar la
energía solar para sintetizar carbohidratos a partir de bióxido de carbono atmosférico y agua.
Muchas plantas almacenan grandes cantidades de carbohidratos que en algunos casos sirven
de alimento para el hombre y animales. Los carbohidratos consumidos por organismos
animales son convertidos en bióxido de carbono y agua o almacenados temporalmente como
GLUCÓGENO en el hígado y músculos. Durante la oxidación de los carbohidratos se libera
energía que es empleada para formar enlaces químicos de numerosos compuestos o
convertirla en trabajo eléctrico, mecánico, osmótico, etc.
Una de las características fundamentales de los seres vivos es su capacidad de adaptación al
medio que los rodea. El mantenimiento de las funciones específicas de los distintos órganos
requiere un aporte energético continuo, cuyas características vienen determinadas por el
volumen y composición de la ingesta y por la capacidad de almacenamiento y regulación de
algunos tejidos. El hígado juega un papel regulador esencial debido a la complejidad de
diversidad de su maquinaria metabólica. Es el órgano que recibe y procesa las sustancias
nutritivas procedentes de la ingesta y que, junto con el tejido adiposo, es capaz de almacenar
sustancias de reserva en forma de triglicéridos y glucógeno.
II. OBJETIVOS
Determinar la cantidad de glucógeno almacenado en el hígado en diferentes condiciones
metabólicas.
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Análisis de experimentación: 3 ratas de similares características (“a” “b” y “c”)
Condiciones experimentales:
Rata “a”: Tres días de ayuno.
Rata “b”: Tres días de ayuno y luego 24 horas de sobrealimentación.
Rata “c”: En condiciones normales de alimentación.
Para cada grupo de trabajo:
Tubos de centrifuga, de 15 mL de capacidad.
Tubos de ensayo con 15 mL de capacidad.
Baño de agua hirviendo.
Centrífuga.
Balanza analítica.
Vasos de precipitado de 50 mL.
Papel aluminio.
KOH 30%.
CURSO: BIOQUIMICA
- Completar con agua destilada hasta 10 mL.
- Medir la absorbancia de cada tubo a 540 nm, ajustando a 0 con un tubo blanco
(preparado con todos los reactivos, reemplazando la muestra por agua destilada).
- Calcular el contenido total de glucosa en el hígado de cada una de las ratas, utilizando
la curva estándar.
PREPARACIÓN DE LA CURVA ESTÁNDAR
- A partir de la solución stock de glucosa (5 mg/ml), preparar 5 ml de solución patrón,
preparar cada una de las siguientes concentraciones: 0.25, 0.5, 1.0 ,1.25, 1.5, 2 y 2.
mg de glucosa por mililitro.
- Tomar 0.5 mL de cada concentración de patrón.
- Añadir 0.5 mL de reactivo DNS y 1 mL de agua a cada tubo. Calentar los tubos en baño
maría hirviendo por 5 minutos.
- Enfriar y ajustar volumen a 5 ml con agua destilada.
- Medir la absorbancia a 540 nm y graficar la curva, ploteando absorbancia vs mg de
glucosa por mL.
CUESTIONARIO
- Compare y discuta los resultados obtenidos.
- Explique el fundamento de la técnica empleada para la cuantificación del glucógeno.
- ¿Existe alguna diferencia entre el glucógeno almacenado en el hígado y en el
músculo?
- De no contar con el ácido 3,5-dinitrosalicilico, ¿Qué otros métodos podrían emplear
para cuantificar el glucógeno? Explique el fundamento de al menos otros dos
métodos.
- ¿Obtendría el mismo resultado si usase el etanol al 75% (grado farmacéutico) en lugar
de etanol al 95% para precipitar el glucógeno?
CURSO: BIOQUIMICA
PRACTICA N° 3
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
I. OBJETIVOS:
a) Determinar la concentración de proteínas en diferentes muestras.
b) Familiarizar al estudiante con un método de cuantificación de proteínas.
II. MATERIALES Y METODOS:
DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BIURET
Fundamento
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu
2+
y los grupos NH de los enlaces
peptídicos en medio básico. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la
cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera
que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es baja y solo se recomienda
para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados.
2.1 Materiales:
Gelatina a distintas concentraciones.
Albumina de huevo a distintas concentraciones.
Reactivo de Biuret*.
Espectrofotómetro.
Estándar de proteína.
Pipetas y micro pipetas.
Tubos de ensayo.
Celdas.
*Reactivo de Biuret
Disolver 3.8 g de CuSO 4
.5H 2
O y 6.7 g de NaEDTA en 700 ml de H 2
O.Agitar e ir añadiendo
200 ml de NaOH y luego 1g de Kl como estabilizante.
