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Práctica de laboratorio de autólisis para la extracción de invertasa
Tipo: Exámenes
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Resumen - El proceso de autólisis celular, que es la desintegración celular que ocurre después de la muerte celular, no implica la participación de bacterias, sino que depende únicamente de las enzimas celulares. La autólisis se inicia con la falta de oxígeno celular, lo que causa daños irreversibles en la estabilidad de la membrana celular, la síntesis de proteínas, la cadena respiratoria y el material nuclear. Esto conduce a la desestabilización de las membranas celulares y organelos, afectando el intercambio iónico y de fluidos, así como el pH celular, lo que resulta en la liberación de enzimas hidrolíticas al citoplasma y la digestión de los componentes celulares. El proceso de extracción de la enzima invertasa de levadura implica romper las células para liberar las enzimas intracelulares. Se han desarrollado y optimizado diversos métodos de extracción, desde la lisis mecánica hasta la lisis enzimática y la extracción con solventes orgánicos, centrándose en romper la pared celular y separar los componentes para obtener la invertasa activa. Palabras clave – Autólisis, extracción enzimática, invertasa, purificación de enzimas. Objetivos – En la siguiente practica se buscará lograr conocer ycomprender el proceso de autólisis en células y tejidos, explorando sus mecanismos subyacentes, sus aplicaciones prácticas en diversos campos y su relevancia en la industria alimentaria y biotecnológica.. Mostrando los siguientes objetivos:
Arroyo Machuca Enrique 18090410, López Martínez Ruth Noemí 18090459, Peralta Medrano Alberto Chanel 20090548, Ronces Lastra Luis Eduardo Jared. C18090372, Vargas Sánchez Maetzy. 21090383. Tecnológico Nacional de México campus Zacatepec. Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica. Asignatura: Biotecnología enzimática.
células se descomponen y degradan a sí mismas. Ocurriendo después de la muerte celular o en condiciones de estrés cellular (cambios en la temperatura, el pH, la concentración de oxígeno, velocidad de agitación, la cantidad de nutrientes, la presencia de sustancias tóxicas, etc.). Comenzando mediante la hipoxia produciendo daño celular severo en la estabilidad de la membrana celular, en la síntesis de proteínas, la cadena respiratoria celular y en el material nuclear. Durante dicho proceso las células liberan enzimas hidrolíticas, como las proteasas, nucleasas y lipasas, que descomponen los componentes celulares, como proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos, en moléculas más simples. Desestabilizando la estructura de las membranas celulares y de sus organelos, generando cambios en el intercambio iónico y de fluidos, los que adicionados a los cambios hidroelectrolíticos y del pH. En ejecución, existen varios tipos de autodestrucción celular, como pueden ser:
Se basa en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a una de color intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante interaccionan con los grupos amino de las proteínas. Dicha reacción se mide por absorbancia a 595nm y también existe una relación lineal dentro de DNS: determinadas concentraciones de proteínas. Presenta una sensibilidad de 20 a 140 microgramos de proteína para el ensayo estándar y de 1 a 50 microgramos para el microensayo. III. MÉTODO EXPERIMENTAL En el presente experimento se utilizó: Materiales: ● Frascos de vidrio con tapa de 100 mL estériles. ● Micropipeta de 100 a 1000 mL. ● 10 tubos bacteriológicos con tapa. ● Termómetro ● Tubos para centrifuga de 15 mL. ● Celdas para el espectrofotómetro. ● Probeta de 100 mL. ● 4 matraz volumétrico de 25 mL. ● 2 matraz volumétrico de 250 mL. ● 1 matraz volumétrico de 1 L. ● 5 vasos de precipitado de 50 mL. ● Agitador de vidrio. Equipo: ● Parrilla de agitación magnética. ● Balanza analítica. ● Termobaño. ● Cronómetro. ● pHmetro ● Centrífuga Reactivos: ● NaOH. ● Bicarbonato de sodio. ● Ácido 3,5 dinitrosalicílico. ● Tartrato de sodio y potasio. ● Glucosa. ● Sacarosa. ● Acetato de sodio. ● Ácido acético glacial. ● Kl ● CuS045 H2O ● Levadura de cerveza en polvo. ● Agua destilada. Preparación de soluciones Solución de Bicarbonato de sodio 0,1 M (250 mL): Se pesaron 2.1g de NaHCO3, se disolvieron en una pequeña cantidad de agua destilada y posteriormente se aforó a 250mL en un matraz volumétrico. Solución de hidróxido de sodio 2 M (250 mL): Se pesaron 20g de NaOH, se disolvieron en agua destilada para posteriormente se aforó a 250mL en un matraz volumétrico. Buffer de acetato de sodio 0.04 M (1 L): Se pesaron 3.28g de C2H3NaO2, se disolvieron en agua destilada y se aforaron a 1L en un matraz volumétrico. Posteriormente se pesaron 2.4g de CH3COOH glacial y se aforaron de igual manera a 1L en un matraz volumétrico.Se procedió a mezclar ambas soluciones hasta lograr un pH de 4.7. Solución de sacarosa de 10 mg/mL (25 mL): Se pesaron2.5g de reactivo Sacarosa, se disolvieron en agua destilada hasta aforar en un matraz volumétrico de 25mL. Solución de glucosa de 10 mg/mL (25 mL): Se pesaron2.5g de Glucosa grado reactivo, se disolvieron
en agua destilada y se aforaron en un matraz volumétrico de 25mL. Solución de Albúmina de suero bovino 10 mg/mL ( mL): Se pesaron 2.5g de proteína Albúmina, se procedió a disolver en agua destilada y se aforó a 25mL en un matraz volumétrico. Solución estándar de BSA: Se pesaron 4 mg de BSA en balanza analítica y se disolvieron en 4 ml de agua destilada. Solución de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) 1L: Se pesaron 10 g de DNS, se disolvieron con agitación en 400 mL de agua destilada. Se añadieron 200 mL de NaOH 2 M una vez se hubo disuelto el DNS (se observó un cambio de coloración de amarillo a naranja). Se pesaron 300 g de tartrato de sodio y potasio y se agregaron lentamente a la solución anterior. Finalmente se aforó a 1L con agua destilada en un matraz volumétrico. Se almacenó en un frasco hermético ambar. Extracción de invertasa Se preparó una solución acuosa de levadura. Agregando 15 g de levadura, 10 g de bicarbonato de sodio, en 250 mL de agua. Posteriormete se vació a unfrasco contapa. Se dejó reposar durante un periodo de 24 h. Periódicamente se liberaban los gases formados. Se tomó una muestra y secolocó, en un tubo de centrifugación. El peso de la muestra junto al tubo para centrifugar fue de 8 0.119g. Se centrifugó a 2900 rpms, 15 min y 15ºC y se recuperó el sobrenadante. Cuantificación de la actividad del extracto. Se incubó 1mL de extracto de invertasa y 1mL de solución de sacarosa durante 10min. Después se agregaron 2mL de DNS y se llevó a baño María hasta cambiar su coloración de amarillo a naranja. Se procedió a leer en espectrofotómetro a 540nm previamente calibrado con un blanco hecho a partir de 1mL de sacarosa y 1mL de DNS. Determinación de contenido de proteínas. Se colocó 1mL de sobrenadante y 3mL de reactivo Bradford en un tubo de ensaye. Se calibró el espectrofotómetro a 465nm con un blanco preparado con 3mL de reactivo Bradford y 0.1 mL de agua destilada. Se leyó la muestra tomando en cuenta futuros cálculos por dilución. IV. RESULTADOS En la presente práctica, se llevaron a cabo mediciones para realizar la curva estándar de la glucose, albúmina para determinar la actividad de invertase y proteína para así obtener la actividad específica. A continuación se observan los resultados experimentales. Figuras. Fig. 1. Tabla de datos de absorbancia con respecto ala concentración de glucosa.
de proteína aumente la actividad enzimática disminuirá y viceversa. Estos resultados nos indican que es de suma importancia la extracción de invertasa de levadura para su aplicación posterior en diversos procesos industriales, investigaciones y la optimización en la mejora de las condiciones de extracción y medición de actividad enzimática. Podemos decir que la extracción de enzimas invertasa de levadura ha demostrado ser un proceso efectivo para la obtención de la actividad enzimática de estas mismas, siempre y cuando los procedimientos a realizar se hagan de manera correcta y exacta. Por último, cabe resaltar que hemos cumplido con la competencia a desarrollar en su totalidad proporcionándonos una visión más amplia sobre estos procesos y sus diversas aplicaciones en diferentes áreas. REFERENCIAS. [1] Fuente: Castañeda, D. I. M. (s/f). Enzimas de interés biotecnológico. Edu.ar. Recuperado el 3 de marzo de 2024, de https://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/ 89649/Apunte_de_c%C3%A1tedra.pdfPDFA.pdf? sequence=1&isAllowed=y [2] Fuente: Gaspar, A. (2023, abril 16). Qué es la autolisis en personas. AVEEC. https://aveec.org/suicidio/que-es-la-autolisis-en- personas/?expanded_article= [3] Sack, P. (s/f). Qué es autolisis – enfermedad- tratamientos. Parkinsoncantabria.com. Recuperado el 3 de marzo de 2024, de https://parkinsoncantabria.com/enfermedad- tratamientos/que-es-autolisis/ [4] Marcela Vega Ferreira, Aline Farias Rossler, Ricardo Peraça Toralles, Walter Augusto Ruiz, & Cesar Valmor Rombaldi. (2018). Extracción optimizada y purificación parcial de invertasa aislada de S. Cerevisiae en puré de durazno. Revista Brasileira de Fruticultura , 40 (2). https://doi.org/10.1590/0100- 29452018489