MÁSTER EN CIENCIAS ANALíTICAS Y BIOANALíTICAS
Trabajo Fin de Máster
Cuantificación absoluta del grado de fosforilación global y
específico de fosfoproteínas empleando capHPLC-ICPQQQ
Laura Freije Carrelo
Julio 2014, Oviedo
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Derecho administrativo, Esquemas y mapas conceptuales de Derecho Administrativo
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Tipo: Esquemas y mapas conceptuales
2020/2021
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MÁSTER EN CIENCIAS ANALíTICAS Y BIOANALíTICAS
Trabajo Fin de Máster
Cuantificación absoluta del grado de fosforilación global y
específico de fosfoproteínas empleando capHPLC-ICPQQQ
Laura Freije Carrelo
Julio 2014, Oviedo
UNIVERSIDAD DE OVIEDO
Centro Internacional de Postgrado Máster en Ciencias Analíticas y Bioanalíticas
Jorge Ruiz Encinar , Profesor Titular del Departamento de Química Física y Analítica de la
Facultad de Química de la Universidad de Oviedo.
CERTIFICA:
Que el presente Trabajo, titulado Cuantificación absoluta del grado de fosforilación global
y específico de fosfoproteínas empleando capHPLC-ICPQQQ
ha sido realizado por el licenciado Laura Freije Carrelo, en el Departamento de Química
Física y Analítica de la Universidad de Oviedo bajo su dirección, constituyendo el Trabajo de
Fin de Máster del interesado en el curso académico 2013-14, y cuya presentación autorizo.
Oviedo, 24 de Junio de 2014
Fdo: Jorge Ruiz Encinar
ÍNDICE
D.3.1. Elección de patrones ........................................................................................................... 34 D.3.2. Determinación cuantitativa del grado de fosforilación específico del digerido tríptico de β- caseína ........................................................................................................................................... 35 D.4. IDENTIFICACIÓN DE LOS PÉPTIDOS Y FOSFOPÉPTIDOS MEDIANTE MS MOLECULAR 37
E. CONCLUSIONES ............................................................................................................................. 42
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................................... 44
APÉNDICES .......................................................................................................................................... 50
A.2.1. Fosforilación de proteínas
La fosforilación de proteínas es una de las PTMs más importantes, ya que está involucrada en el control del ciclo celular, diferenciación, proliferación, transformación, metabolismo celular, degradación de proteínas, homeostasis… Los enzimas responsables de la fosforilación y defosforilación son, respectivamente, las quinasas y fosfatasas, que emplean casi exclusivamente adenosín trifosfato (ATP) como donador del grupo fosfato. En las células eucariotas, dicho grupo fosfato forma un enlace fosfoéster con el grupo hidroxilo de los aminoácidos serina (Ser), treonina (Thr) y tirosina (Tyr), como se esquematiza en la Figura 1.7,8^ La fosforilación en Ser o Thr es mucho más abundante que la fosforilación en Tyr. En vertebrados, la relación de fosforilación en Ser:Thr:Tyr es 1800:200:1.^9
Figura 1. Proceso de fosforilación/defosforilación en células eucariotas.
Aunque se estima que al menos un tercio de todas las proteínas celulares se encuentran fosforiladas en algún momento, sus niveles de fosforilación varían ampliamente, lo que dificulta su estudio. Sin embargo, la importancia de la fosforilación ha sido ampliamente descrita en la bibliografía. En procesos de señalización, la fosforilación supone una activación o desactivación de la actividad de la proteína. Un desorden en el sistema de control habitualmente desemboca en enfermedades.^8 Por ejemplo, la fosforilación tiene un papel relevante en enfermedades como el cáncer,10,11^ la diabetes,^12 respuestas frente a virus y necrosis programadas^13 o enfermedades cardiacas,^14 entre muchas otras. Interviene también en la regulación de la mitosis^15 y en diversos procesos cerebrales.16,
En definitiva, existe un gran interés en el estudio de la fosforilación y, en concreto, en el desarrollo de estrategias para la determinación cualitativa y cuantitativa de fosfoproteínas, dada su importancia en los procesos biológicos.
Proteína fosfatasa Proteína quinasa
ATP
ADP
Pi
H 2 O
R-OH
O
R—O—P—O-
O-
A.3. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE FOSFOPROTEÍNAS
Las primeras metodologías para el análisis de fosfoproteínas únicamente proporcionaban resultados cualitativos, identificando las fosfoproteínas presentes en la muestra. Sin embargo, las respuestas celulares dependen no sólo de la identidad de la fosfoproteína sino también de los sitios de fosforilación, estequiometría y cambios temporales en el grado de fosforilación. Por todos estos motivos, es necesario el desarrollo de estrategias cuantitativas en fosfoproteómica.^18
Los análisis cuantitativos pueden proporcionar la cantidad absoluta de proteína en una muestra o el cambio relativo en la cantidad de proteína entre dos estados. La cuantificación absoluta es la determinación de la cantidad de la especie concreta, por ejemplo, ng mL-1^ de un biomarcador o el número de copias de una proteína por célula. En cambio, en cuantificaciones relativas la cantidad de proteína se define en relación con otra medida de la misma proteína, comparando así, al menos, dos estados celulares. Como es obvio, la cuantificación absoluta permite también una determinación relativa fácilmente.^19
En este apartado se describirán los métodos disponibles para la cuantificación de fosfoproteínas, clasificados según las técnicas empleadas (métodos tradicionales, espectrometría de masas molecular y espectrometría de masas elemental) y distinguiendo si proporcionan una cuantificación relativa o absoluta.
A.3.1. Métodos tradicionales
A.3.1.1. Cuantificación relativa
Los primeros trabajos publicados para la detección y determinación de proteínas empleaban electroforesis en geles de poliacrilamida de una o dos dimensiones.^4 La electroforesis en gel de dos dimensiones es una técnica poderosa para separar y aislar proteínas, pudiendo incluso resolver diferentes PTMs de una proteína dada.
Para la detección de fosfoproteínas, se incorpora in vivo o in vitro 32 P. Posteriormente, las bandas de las proteínas se detectan en una película de autorradiografía o con equipos de imágenes digitales.^6 El marcaje con 32 P presenta varios inconvenientes. En primer lugar, el tejido debe poder ser marcado radiactivamente y no siempre la eficacia del marcaje es elevada. Además, altos niveles de 32 P pueden provocar daños celulares y alterar los niveles de fosforilación. Por último, el laborante se ve sometido a elevadas cantidades de radiactividad, con los peligros que ello conlleva. En cuanto a la posibilidad de cuantificación, ésta es poco precisa ya que se basa en la comparación de las bandas observadas en las placas radiográficas.20,
Otra técnica aplicada en la detección de fosfoproteínas es la técnica Western-Blot, que emplea anticuerpos fosfoespecíficos. Una importante limitación es que los anticuerpos anti-
A) B)
Figura 2. Enriquecimiento de fosfopéptidos: A) IMAC; B) MOAC.^24
IMAC se basa en la afinidad de los grupos fosfato por iones metálicos (Fe3+, Ti4+, Ga3+, Al3+, Zr4+…) inmovilizados en la fase estacionaria gracias a diversos quelantes.25,26^ Las mayores limitaciones del método son la unión de péptidos no fosforilados que contienen un alto número de residuos de aminoácidos ácidos y la influencia de la naturaleza del material, el quelante empleado y las condiciones de elución. Se han desarrollado recientemente diferentes estrategias para superar estos inconvenientes y mejorar el enriquecimiento, por ejemplo, empleando microesferas magnéticas^27 o IMAC-IMAC.^28
Debido a las limitaciones nombradas, MOAC surgió como alternativa a IMAC en 1997.^29 Se basa en el empleo de resinas de óxidos metálicos, fundamentalmente TiO 2 , que permite obtener mayor selectividad y recuperación de fosfopéptidos.^30
La cromatografía de intercambio catiónico (SCX) también se ha empleado en el enriquecimiento de fosfopéptidos (Figura 3.A). El enriquecimiento mediante SCX se debe a las diferencias entre cargas que presentan en disolución los fosfopéptidos respecto a los péptidos no fosforilados. A pH=2.7 un péptido tríptico típico suele tener carga neta +2 mientras que el mismo péptido fosforilado reduce la carga en una unidad.^8 La elución se produce aplicando un gradiente de sales. Aunque el método aún no es totalmente específico para fosfopéptidos,^31 ha sido empleado como un primer paso de separación seguido de IMAC o MOAC en múltiples trabajos.32-
A) B)
Figura 3. Enriquecimiento de fosfopéptidos: A) SCX; B) Inmunoprecipitación p-Tyr.^24
Recientemente, la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) ha demostrado ser una herramienta poderosa en la separación de fosfopéptidos.^35 Emplea una columna con fase estacionaria polar y fase móvil parcialmente hidrofílica, de modo que los péptidos son retenidos en proporción a su hidrofilicidad. Tiene como ventaja que no requiere adición de sales no volátiles a las muestras (como en SCX) y por tanto puede ser acoplada online a MS.^36
También se ha aplicado la cromatografía líquida de interacción de repulsión hidrofílica (ERLIC). La separación se puede llevar a cabo en isocrático ya que la columna (intercambio aniónico débil) presenta una carga similar a los analitos pero el disolvente contiene suficiente fase orgánica para forzar a los solutos a permanecer en la columna a pesar de la repulsión electrostática.^37 Esta técnica está ganando popularidad en los últimos años.^38
Finalmente, el empleo de anticuerpos permite la inmunoprecipitación específica en una muestra compleja de una proteína que se sospecha que pueda estar fosforilada (Figura 3.B). La inmunopurificación más empleada utiliza anticuerpos antifosfoTyr ya que presentan mayor eficacia que los pSer y pThr. En este caso, es necesario el uso de métodos alternativos.^39
A.3.2.2. Cuantificación relativa
Aunque la espectrometría de masas molecular ha probado ser una extraordinaria herramienta para la caracterización de proteínas, la medida de las intensidades de los péptidos no proporciona información cuantitativa de forma directa, ya que la eficiencia de ionización en MS molecular varía dependiendo de las propiedades físico-químicas del péptido y la presencia de otros componentes en la matriz. Por este motivo, se han desarrollado fundamentalmente estrategias de cuantificación relativa basadas en el marcaje con isótopos estables, por comparación de una muestra que mantiene el elemento natural con otra muestra que incorpora la marca isotópica.^19
Las características y propiedades físico-químicas de los péptidos sin marcar y marcados con isótopos estables permanecen semejantes exceptuando la diferencia de masa introducida por la marca isotópica. Tras mezclar las dos poblaciones, los péptidos se analizan simultáneamente, apareciendo como pares (dobletes) en el espectro de MS. Las intensidades del doblete permiten realizar la cuantificación de péptido relativa para las dos muestras comparadas.^8
Los marcajes se clasifican, según el momento en el que se realizan, en marcajes in vivo o in vitro , también denominados metabólico o químico, respectivamente. En la Figura 4 se esquematizan los diferentes tipos de marcaje que serán descritos a continuación más detalladamente.
A.3.2.2.2. Marcaje in vitro o químico
Otra posibilidad para la cuantificación relativa consiste en modificar químicamente los dos proteomas bajo estudio, antes o después de la digestión proteolítica, derivatizando químicamente los péptidos. Existen fundamentalmente dos estrategias: Marcaje isotópico o marcaje isobárico.
El marcaje isotópico diferencial de afinidad (ICAT) emplea un reactivo dirigido a la cisteína que puede incorporar 1 H o deuterio. Las muestras se marcan una con el reactivo ICAT ligero (con 1 H) y otra con el pesado (con deuterio), resultando en una diferencia en masa de 8 Da.^43 Este procedimiento sólo permite la cuantificación de sitios de fosforilación presentes en los péptidos trípticos marcados químicamente. Sin embargo, el marcaje también puede dirigirse específicamente a fosfoSer y fosfoThr por β-eliminación del fosfato y adición de 1,2-etanoditiol marcado isotópicamente (PhIAT).^44
Otra estrategia de marcaje emplea metanol común o deuterado para derivatizar el grupo C- terminal de los fosfopéptidos en O-metil ésteres.^45 Una estrategia similar derivatiza las aminas por dimetilación con formaldehido normal o deuterado.^46 Finalmente, otra posibilidad combina una digestión con tripsina y agua con 16 O y 18 O seguida de formación de un O-metil éster usando metanol con 16 O u 18 O.^47
Por otra parte, se han desarrollado reactivos para marcaje isobárico (iTRAQ o TMT), que reaccionan con los extremos N-terminales y los residuos de lisina después de digerir la proteína. Los péptidos de diferentes muestras se marcan con reactivos que tienen la misma masa nominal. Sin embargo, cuando se someten a MS/MS, cada marca se disocia del péptido produciendo iones con menor m/z diferenciados en 1 Da. Esto permite cuantificar de forma relativa hasta 4 muestras diferentes.^48
A.3.2.3. Cuantificación absoluta
Los métodos descritos en el apartado anterior permiten obtener las abundancias relativas de hasta cientos de sitios de fosforilación específicos. Sin embargo, la cuantificación absoluta mediante MS molecular requiere el uso de patrones específicos de cada péptido, debido a la variabilidad de la eficiencia de ionización de los péptidos ya comentada.
Una metodología común consiste en sintetizar químicamente péptidos marcados isotópicamente a través de tecnología AQUA y después añadirlos en una cantidad determinada a la muestra como patrones internos. El espectro de masas obtenido está representado por un doblete de picos espectrales separados una m/z determinada correspondiente al marcaje, de modo que la cuantificación se realiza mediante dilución isotópica. El empleo de esta estrategia para el análisis de (fosfo)proteínas requiere la síntesis de (fosfo)péptidos trípticos marcados isotópicamente y, en el caso de que se encuentren fosforiladas, estas deben contener el sitio de fosforilación buscado. Obviamente, la secuencia de la (fosfo)proteína debe ser conocida de antemano.^49
Otra estrategia para la cuantificación absoluta se conoce como QconCAT y se basa en la síntesis artificial mediante ingeniería genética de una cierta proteína formada por varios péptidos trípticos marcados isotópicamente. Al igual que en el caso de AQUA, la secuencia debe ser conocida de antemano.^50
A.3.3. Espectrometría de masas elemental
La espectrometría de masas molecular es una herramienta útil para la evaluación de cambios entre una muestra y otra (cuantificación relativa). Sin embargo, las estrategias de cuantificación absoluta mediante MS molecular requieren la síntesis química de cada fosfopéptido y, por tanto, están limitadas a proteínas con fosforilaciones conocidas y a la disponibilidad de fosfopéptidos marcados isotópicamente.
Hoy en día, la espectrometría de masas elemental con fuente de plasma de acoplamiento inductivo (ICPMS) es una técnica ampliamente reconocida para el análisis de biomoléculas que contienen elementos detectables mediante ICP, pudiendo aplicarse también a proteínas, ya que estas contienen heteroátomos (cualquier elemento presente en la biomolécula que sea diferente de C, H, O, o N), por ejemplo, S, P, Se ó diversos metales (Zn, Fe, Mn...).^51
El empleo de ICPMS presenta varias ventajas: bajos límites de detección para la mayoría de elementos, mínimos efectos de matriz, amplio rango lineal, información de relaciones isotópicas y facilidad en el acoplamiento con técnicas de separación.^52 Sin embargo, la característica más excepcional es que la respuesta elemental obtenida con ICPMS, bajo ciertas condiciones, puede ser directamente proporcional a la cantidad absoluta del elemento medido, independientemente de la estructura del compuesto. Esto posibilita el desarrollo de metodologías para la cuantificación absoluta de (fosfo)proteínas con ICPMS empleando patrones genéricos. De este modo, se podría monitorizar (fosfo)proteínas de forma simultánea o calcular su recuperación en preparaciones y purificaciones de muestra.^53
Por contra, el ICPMS como analizador elemental que es, no puede distinguir entre las distintas especies que contienen un determinado elemento en una muestra, a no ser que dichas especies lleguen al plasma separadas en el tiempo. De ahí que el empleo del ICPMS en proteómica esté supeditado al uso de una técnica separativa acoplada (normalmente cromatografía) lo suficientemente eficiente que permita aislar completamente las especies en estudio.
A.3.3.1. Análisis de 31 P y 32 S por ICPMS
Las proteínas contienen heteroátomos de forma natural que pueden ser medidos mediante ICPMS. El azufre está presente en los aminoácidos cisteína (Cys) y metionina (Met). Estadísticamente, un péptido o proteína que contenga más de 20 aminoácidos contendrá al menos un
Sin embargo, la técnica híbrida más empleada para estudios de especiación biológica es la basada en el acoplamiento de HPLC-ICPMS.^60 En concreto, HPLC en fase reversa (RP-HPLC) ofrece mejores características para separación de péptidos.^61
El acoplamiento de RP-HPLC con ICPMS presenta un importante problema: las fases móviles empleadas contienen altos porcentajes de modificadores orgánicos, que afectan negativamente a la estabilidad del plasma y producen un descenso en su temperatura. Como consecuencia, se produce una acusada variación de la sensibilidad del elemento medido a lo largo del gradiente, especialmente para elementos con altos potenciales de ionización, como P y S. Esto supone una importante limitación para el desarrollo de metodologías de cuantificación absoluta. Además, se forman depósitos de carbono en los conos que producen fuertes efectos de deriva.^62
Una estrategia para minimizar el impacto de las fases móviles con altos porcentajes de modificadores orgánicos consiste en reducir el flujo a los niveles de HPLC nano y capilar (capHPLC) y el empleo de micronebulizadores de consumo total.55,63^ En la Tabla 1 se muestran comparativamente los parámetros típicos en HPLC convencional, capilar y nano.
Tabla 1. Comparación entre HPLC convencional, capilar y nano.
Cromatografía
Diámetro interno de la columna
Rango de flujos típicos
Convencional 3.2 – 4.6 mm 0,3 - 1 mL/min
Capilar (^) 250 – 500 μm 1 – 10 μL/min
Nano 10 – 150 μm 10 – 1000 nL/min
El empleo de capHPLC presenta además algunas ventajas, como son la alta eficacia de separación, bajo consumo de fase móvil y bajo consumo de muestra, además de una drástica reducción de los iones poliatómicos que interfieren, fondos más bajos y mejores LD.^63
Desafortunadamente, el empleo de capHPLC no es suficiente por sí solo para corregir la variación de la sensibilidad producida durante el gradiente. Una alternativa para minimizar la fuerte variación de la señal de P y S durante el gradiente en RP-HPLC consiste en emplear un flujo post- columna que contenga el mismo modificador orgánico durante el gradiente. Este concepto fue probado, inicialmente, empleando nanoHPLC-ICPMS para el análisis de biomoléculas que contienen Co and Se.^64
A.3.3.3. Cuantificación de fosforilación de proteínas empleando ICPQMS
Teniendo en cuenta las aproximaciones descritas en el apartado anterior, Ana Pereira Navaza et al. desarrollaron una cuantificación independiente de la matriz y de la especie para fosforilación de proteínas mediante cap-RP-HPLC acoplado a ICPQMS (tipo cuadrupolo equipado con una celda de colisión) y empleando como patrón de cuantificación un estándar comercial de P.^65
En esta metodología, la adición de un flujo postcolumna al 40% de acetonitrilo (ACN) logra mantener constante la sensibilidad de 31 P durante la parte del gradiente donde eluyen los (fosfo)péptidos, de modo que la señal de 31 P obtenida puede ser directamente proporcional a la masa de 31 P presente en la especie e independiente de su estructura química. Se logra así una cuantificación absoluta y genérica de fosfopéptidos seleccionando bis(4-nitrofenil) fosfato (BNPP) como patrón genérico.
La metodología se aplicó a la cuantificación absoluta de la fosforilación de dos patrones de fosfopéptidos y a un digerido tríptico de β-caseína de leche bovina. Puesto que el ICPQMS sólo permite una medida adecuada del 31 P, una determinación absoluta del grado de fosforilación requiere conocer la concentración exacta de proteína. Para ello, en primer lugar se determinó el P total en el digerido mediante adiciones estándar y capFIA-ICPMS y, a continuación, el P inorgánico por microcentrifugación y medida del P en el filtrado. Se calculó además la recuperación de las especies de P de la columna de fase reversa ya que para la cuantificación de fosfopéptidos se requiere que la suma total de P cuantificados para los fosfopéptidos coincida con el total de P enlazado a los péptidos inyectados y eluídos de la columna de fase reversa empleada. Finalmente, se adicionó el BNPP al digerido tríptico y, teniendo en cuenta la recuperación de la columna, el P total y el P inorgánico presente, se calculó el grado de fosforilación de la β-caseína, mediante capHPLC-ICP-MS. El acoplamiento de capHPLC a ESIQ-TOF posibilitó la elucidación de las secuencias de aminoácidos de cada péptido.
Esta metodología se aplicó para la evaluación de procesos de enriquecimiento de fosfopéptidos basados en el uso de cartuchos de TiO 266 y la determinación de la cinética de fosforilación/defosforilación.^67
A.3.3.4. Cuantificación de fosforilación de proteínas empleando ICPQQQ
La metodología descrita en el apartado A.3.3.3 emplea únicamente la medida de 31 P, ya que el ICPMS equipado con un único cuadrupolo no permite una medida adecuada de 32 S debido a las serias interferencias poliatómicas que presenta este elemento.
El desarrollo de un ICP equipado con un triple cuadrupolo (ICPQQQ) ha supuesto un importante avance en la cuantificación absoluta de proteínas y fosfoproteínas. Este equipo se basa en el concepto de MS en tándem (QQQ) típicamente usado en MS molecular.
fosforilación en proteína intacta acoplándolo a cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) mediante un nebulizador convencional. En primer lugar, se realizó un calibrado de la relación molar P/S en base a la relación de áreas obtenida para los patrones genéricos BNPP y Metionina. A continuación, se analizó β-caseína intacta acoplando la columna de SEC al ICPQQQ. Tras calcular la relación de áreas, se obtuvo la relación molar P/S y, finalmente, el grado de fosforilación de la proteína.