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Un estudio sobre el proceso tecnológico para la separación de pectinliasas, pectinesterasas y poligalacturonasas en preparados comerciales de pectinasas mediante cromatografía pseudobioespecífica. la importancia de este proceso en la industria de los jugos de fruta y la justificación de su realización a escala industrial. Se discuten los conceptos básicos de la cromatografía, la clasificación de las diferentes técnicas y la importancia de la cromatografía de afinidad en este contexto.
Tipo: Apuntes
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Presentado por ALBERTO MAURICIO MARTINEZ LAFAURIE 242537 Presentado a I.Q. MARIO VELÁSQUEZ UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA Bogotá D.C. 31 de mayo de 2005
En la actualidad, la gran cantidad de compuestos tanto de origen químico como bioquímico hacen necesaria la inclusión de diferentes y numerosas técnicas de separación de los compuestos que se hallan, con el fin de obtener los beneficios que estos ofrecen. Una de las técnicas más estudiadas durante el desarrollo del curso trata de la cromatografía; la cual tiene como principio de separación la migración diferencial; es decir un retardo selectivo de las moléculas de soluto durante su paso a través del lecho de resina. El uso de la cromatografía está ampliamente extendido en el análisis de alimentos, medicinas, sangre, productos petrolíferos y de fisión radiactiva. Así pues, dentro del marco de estudio de cromatografía, existe una clasificación que es de gran interés para la realización de este trabajo: Cromatografía de afinidad. La cual utiliza un ligando en la superficie de la fase estacionaria con el fin de atrapar la molécula del soluto que sea afín con el ligando , generando de esta forma un enlace químico lo suficientemente fuerte para que el soluto evite ser arrastrado o eluido. Si bien la cromatografía de afinidad es usada extensivamente en el laboratorio, su aceptación se ha visto limitada en escalas mayores debido a los altos costos que presentan los ligandos y debido a su inestabilidad biológica y química. Solo recientemente el desarrollo de nuevos métodos para la selección y el diseño de ligandos sintéticos estables, ha abierto la oportunidad de exploración de diversos materiales a gran escala. Un viejo axioma biotecnológico sostiene que nunca se debe purificar un compuesto más de lo necesario, pues aumentaría el costo del producto final, con la consiguiente desventaja en el mercado. Por ello, se requiere diseñar un procedimiento que asegure una pureza de las enzimas adecuada para su uso. En general, las utilizadas en la industria alimentaria no necesitan una purificación extrema, comparada, por ejemplo, con la requerida por algunas de uso terapéutico. Razón por la cual la cromatografía de afinidad es una de las técnicas mejor recomendadas para el fraccionamiento de compuestos, independientemente del grado de pureza que se necesite. Con lo que se concluye que el estudio de este proceso de separación exige no solamente su realización a escala de laboratorio, sino que hay que tener presente su posible aplicación a escala industrial, disminuyendo costos con base en los ligandos utilizados y también el grado de pureza que se requiere.
Fig 1. Acción de las pectinasas sobre la pectina. A) Efecto directo de la pectinliasa. B) efecto de la poligalacturonasa sobre la pectinliasa. B) efecto de la poligalacturonasa sobre la pectina previamente demetoxilada por la pectinesterasa Como se observa en esa figura, la demetoxilación de la pectina por la pectinesterasa libera metanol, que queda en el jugo; se trata de un caso típico de generación de una sustancia tóxica como parte del procesamiento de un alimento. Por lo general, los jugos se concentran, por calentamiento o por ultrafiltración en el lugar de producción para reducir el flete; luego se los diluye y envasa cerca de los sitios de venta. Aquellos que fueron sometidos a este proceso de concentración y dilución suelen llevar un rótulo que así lo indica y tienen la ventaja de haber perdido casi totalmente el metanol, junto con algunos compuestos aromáticos, debido al concentrado. Pero también se venden jugos que no siguieron los pasos anteriores, distribuidos directamente al público luego de ser prensada la fruta y aclarado el zumo. Son los que conservan el metanol y, por ende, expondrían a los grandes bebedores de zumo a riesgos de los que aún se sabe poco. Algunos estudios realizados en el laboratorio, encontraron dosificaciones de metano de varios jugos de manzana que se distribuyen comercialmente. Encontraron hasta 100mg por litro en los que no fueron concentrados y, si bien no se trata de una cantidad que pueda provocar intoxicación aguda, ni ocasionar problemas de toxicidad subaguda, podría representar un peligro para quienes consumen mucho de esos productos, ya que no se conoce gran cosa sobre la toxicidad subcrónica del metanol. Aclaremos que el vino contiene cantidades superiores de metanol (hasta
300-4OOmg/l), pero coexiste con concentraciones mucho, más altas de etanol, su antídoto biológico. Los investigadores japoneses S. Ishii y T. Yokotsuka demostraron que, utilizando pectinliasa purificada (que no necesita de la acción previa de la pectinesterasa responsable de la liberación de metanol, para degradar a la pectina), se puede aclarar jugo de manzana sin producción simultánea de metanol. Pero el método requiere varias etapas cromatográficas, lo que descarta su utilización práctica por razones económicas. El desafío que se plantearon los científicos fue eliminar la pectinesterasa de un preparado comercial de pectinasas por algún método de purificación que pudiera ser adoptado por la industria, pues, a medida que las reglamentaciones alimentarias se vayan haciendo más estrictas, las industrias deberán adoptar procedimientos que les permitan elaborar productos más saludables. CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD PSEUDOBIOESPECIFICA Los métodos cromatográficos de purificación de proteínas se pueden clasificar según cómo aprovechen alguna propiedad fisicoquímica de las moléculas en estudio. Así, la cromatografía de exclusión molecular separa las moléculas por su tamaño; la de intercambio iónico diferencia la carga eléctrica de ellas, en la de interacción hidrofóbica quedan retenidas en la columna aquellas proteínas que, por las características de los aminoácidos de su superficie, se unen a la matriz excluyendo el agua (son hidrófobas), y la de afinidad se basa en interacciones específicas entre la molécula a purificar y la matriz de la columna. Debido a que el tamaño, la carga eléctrica y la hidrofobicidad de la pectinesterasa son semejantes a los de otras pectinasas presentes en la mezcla, optamos por la cromatografía de afinidad, técnica que, cuando se emplea para inmovilizar un anticuerpo con el propósito de purificar un antígeno (o viceversa), es muy cara y, por lo tanto, sólo aplicable a la purificación industrial de proteínas de gran valor comercial. Pero hay una cromatografía de afinidad, llamada pseudobioespecífica , en la que, para purificar proteínas, se inmovilizan en la matriz colorantes o iones, substancias que, debido a su estructura, simulan algún compuesto natural al que la proteína se une, pues tiene afinidad por él. Aunque se trata de un procedimiento de menor selectividad, es también mucho más barato. Selección del ligando Uno de los criterios estudiados para la selección de los ligandos, consiste en la estructura molecular de la proteína que va a ser atrapada. Para este caso existen dos factores muy importantes para el diseño del ligando por estructura: primero la habilidad de predecir correctamente la conformación del ligando diseñado, y segundo la habilidad de predecir correctamente el enlace4 de afinidad en el diseño del ligando. Sin embargo, esta técnica de selección no en muy apropiada, debido que se requiere de un exhausto estudio de la estructura molecular de la proteína. Ahora bien, existe otra técnica que puede ser utilizada en la selección del ligando más apropiado; consiste en identificar los posibles grupos funcionales del soluto o proteína en este caso, y así encontrar el ligando que se adecue a las condiciones del sistema (en cuanto a soluto y fase estacionaria). Esta es la estrategia que ha sido utilizada para la selección del nuestro ligando Algunos estudios desarrollados, demostraron que se ha de trabajar con cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC, Immobilized Metal ion Affinity Chromatography), que cumple con dos requisitos fundamentales: costo relativamente
Fig 3 Cromatografía de una mezcla de pectinasas en una columna IMAC. Las proteínas se detectan por su absorbancia en 280 NM. La flecha indica el cambio de un medio alcalino (pH 8,0) a un ácido (pH 3.0) Cuando se procedió a clarificar jugo de manzana con cada una de las fracciones y se hizo una dosificación de metanol en los zumos aclarados, se halló, como era previsible, que el alcohol estaba ausente cuando se usaba la fracción I, que no contenía pectinesterasa. En cambio, se había producido metanol, debido a la acción conjunta de la pectinesterasa y la poligalacturonasa al utilizar la fracción II. Una ventaja de esta forma de fraccionamiento es que la pectinesterasa, separada de la mezcla y presente en la fracción II, no se desecha y puede ser utilizada para aclarar jugos que serán concentrados o para otros fines, como la producción de pectina demetoxilada (ácido péctico), que se usa como espesante en la industria de las mermeladas. Como segundo paso, se buscó el procedimiento óptimo de separación en cuanto al solvente cromatográfico, el metal inmovilizado, el flujo cromatográfico, la concentración de la muestra y la fuerza iónica necesaria para retener toda la pectinesterasa en la columna. En la tabla 2 se muestran los resultados obtenidos con distintos metales inmovilizados: cobre, níquel (Ni) y zinc (Zn). Sobre la base de consideraciones de rendimiento y estabilidad del metal inmovilizado en la matriz cromatográfica, se concluyó que el cobre permitía una mejor separación. META L
Cu2+^
Ni2+^
Zn2+^
Tabla 2. Fraccionamiento de pectinasas por IMAC. Influencia del metal unido a la matriz cromatográfica.
Otro de los factores que presenta gran trascendencia en cuanto al desarrollo de la cromatografía, consiste en la influencia de la fuerza iónica, producida por concentración de sales por ejemplo, de cloruro de sodio (NaCl), y del tampón cromatográfico, o líquido de elución, sobre el fraccionamiento por IMAC. Se halló que la pectinliasa no interacciona con la matriz cromatográfica en ninguna condición de fuerza iónica, tanto con tampón Tris (nombre común del Tris-hidroximetil- aminometano) como con tampón fosfato. Por el contrario, la pectinesterasa es adsorbida por la matriz cromatográfica, con mayor interacción al aumentar la fuerza iónica del tampón. Aunque este resultado es cualitativamente similar para las dos soluciones tampón ensayadas, se encontró que el uso de fosfato para la adsorción y acetato para la elución mejora el fraccionamiento cromatográfico con respecto al tampón Tris, ya que se requiere menor concentración de NaCl para obtener adsorción total de la pectinesterasa, lo cual disminuye los costos del proceso. Además, el fosfato es un compuesto fisiológico, más barato que el Tris. Fig 4. Retención de la pectinesterasa en la columna de IMAC según la fuerza iónica, dada por la concentración salina, del tampón utilizado. Por último, se determinaron los parámetros relevantes para pasar, mediante cromatografía frontal, de la escala de laboratorio a la industrial. La técnica consiste en cargar la muestra continuamente en la columna, hasta el momento en que no sea retenida por haberse saturado la capacidad de la matriz. Por supuesto, interesa que la columna retenga la mayor cantidad posible de proteína y que su salida sea abrupta. La figura 5 indica la cantidad de muestra que sale de la columna en función del tiempo: los trazados se conocen como curvas de ruptura y la cromatografía será tanto más eficiente cuanto mayor sea la pendiente de esa curva, ya que la carga de la columna debe finalizar cuando comienza a salir la proteína que se quiere adsorber. Las curvas de ruptura para distintas velocidades a las que la muestra atraviesa la columna. Es preferible el flujo más rápido, que permita conseguir la mejor carga de muestra en la columna, para que el proceso sea más económico: en este caso, una velocidad de 0,80 cm/min cumple con ambas condiciones. La forma de la curva de ruptura depende de la matriz cromatográfica y de las condiciones operativas (flujo, concentración de muestra, etc.).
experimentales de las cuales no se tienen conocimiento, tales como los volúmenes de elución de las enzimas que son removidas ( poligalacturonasa y pectinesterasa ), así como las dimensiones de la columna en las que se realizaron los experimentos. Para comenzar, se deben mencionar las variables y parámetros que van a estar presentes a la hora de emplear el modelo matemático propuesto por Syu et. al.
d : Diámetro de la partícula (Å).
El diagrama de flujo se dará de la siguiente manera:
Vb=0.25dc^2 Vb Calcular b y p con Ved= Vb * b Ved= Veo/(1+(1- b)( p /b)) b, p 1
Rp, Determinar los valores de L, dc, Veo, Ved, Rp, , mediante la realización del experimento. Graficar experimentalmente Cadim vs. adim. Cadim= C()/Co = t / L
Encontrar el valor del área adimensional A
Cambiar el valor de la concentración Co Calcular Ci^ ∞^ y b mediante A=((1- b)(1- p)(( bCi^ ∞)/(1 + b)) + (1- b)p + b) / b
Ci^ ∞, b Determinar el peso molecular M^ Calcular Dm Dm=2.74*10-5^ M-1/ Calcular d d= 1.44 M1/ d dp Calcular = d / dp Dm Calcular Dp Dp Dp = Dm (1 – 2.104 + 2.09^3 – 0.95^5 ) / tor
GU, Tingyue. HSU, Luang-Hsin. SYU, Mei-Jywan. Scale-up of affinity chromatography for purification of enzymes and other proteins. Science direct. Enzyme and microbial technology. Number 33. 2003. LABROU, N. E. Design and selection of ligands for affinity chromatography. Science direct. Journal of chromatography. Number 790. 2003. CAMPERI, Silvia. HOURS, Roque. Jugos de Fruta sin Metanol. Revista de Divulgación Científica y Tecnológica de la Asociación Ciencia Hoy. Volumen 6. Número 33.
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