COMPARACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA
DETERMINACIÓN DE GLUTATIÓN
Módulo Integrador de Química
Profesor a cargo: Dra. Susana Llesuy, Ignacio Bressán.
Integrantes:
• Ametller, Leiza
• Carromba, Martina
• Sobré, Olivia
4 de noviembre de 2020
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COMPARACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUTATIÓN, Monografías, Ensayos de Química
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN DE LA COMPARACIÓN DE METODOS ANALITICOS PARA LA DETERMINACION DE GLUTATION. INDICE: resumen, palabras clave, introducción, métodos, desarrollo, conclusiones, referencias bibliográficas.
Tipo: Monografías, Ensayos
2019/2020
1 / 13
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COMPARACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA
DETERMINACIÓN DE GLUTATIÓN
Módulo Integrador de Química Profesor a cargo: Dra. Susana Llesuy, Ignacio Bressán. Integrantes:
- Ametller, Leiza
- Carromba, Martina
- Sobré, Olivia 4 de noviembre de 2020
Índice
- Resumen ………………………………………………………………………………………
- Palabras Clave ………………………………………………………………………………..
- Introducción ……………………………………………………………………………………
- Métodos ………………………………………………………………………………………..
- Desarrollo………………………………………………………………………………………
- Conclusiones …………………………………………………………………………………
- Referencias bibliográficas …………………………………………………………………..
Introducción Desde el punto de vista químico, la molécula de glutatión reducido (L-y-glutamil-L- cisteinil-glicina) es un tripéptido hidrosoluble formado por los aminoácidos ácido glutámico, cisteína y glicina. Esta molécula contiene un enlace amida entre el grupo amino de la cisteína y el grupo carboxilo de la cadena lateral de glutamato (Figura 1) (1). Esta sustancia es fundamental en la regulación de la homeostasis celular. Entre otras funciones, tiene un rol importante en la defensa contra el daño oxidativo. Dicha función está dada por la capacidad de la forma tiol reducido (GSH) de reducir a otros compuestos al donar electrones, pasando a su forma disulfuro oxidada (GSSG) (2). Fisiológicamente, las células están sometidas a niveles de estrés oxidativo ya que durante la respiración mitocondrial se liberan aniones superóxido y peróxidos. Si estos intermediarios no son reducidos, provocan compuestos tóxicos del oxígeno que causan daño celular y peroxidación lipídica. Las fracciones libres del glutatión se encuentran como GSH y GSSG. (Figura 2). Este equilibrio redox le permite actuar como antioxidante. Los intermediarios de la respiración celular reaccionan con el GSH oxidándolo, por ende, estos se reducen y no forman compuestos tóxicos dañinos para las células. En esta reacción interviene la enzima glutatión peroxidasa (GPx). El GSSG puede volver a ser reducido por acción de la glutatión reductasa (GR). Del mismo modo, GSH reacciona con los intermediarios reactivos del nitrógeno (1). Figura 1. Estructura química del glutatión reducido (GSH)
En la práctica clínica es útil medir las concentraciones plasmáticas de GSH y GSSG (que sumadas representan al glutatión total) ya que actúan como indicadores de funcionalidad celular y del estado oxidativo de tejidos menos accesibles. El glutatión es entonces un biomarcador del estrés oxidativo, que contribuye a la evaluación del estado de salud de un paciente y la respuesta del organismo ante una terapia antioxidante (3)(4). La relevancia de la determinación de la relación GSH/GSSG en plasma permite estimar la capacidad del organismo para neutralizar el exceso de radicales libres durante la actividad oxidativa. En un contexto terapéutico, contribuye a dosificar adecuadamente al paciente, ya que una dosis alta de oxidante en algunos casos puede significar un riesgo para su salud. Por lo tanto, la disponibilidad de glutatión en su forma reducida (GSH) puede ser un factor clave para el mantenimiento de la salud, ya que mantiene un entorno redox óptimo en las células al neutralizar los radicales libres. Dentro de este marco conceptual el objetivo general del presente trabajo es revisar los diferentes métodos para cuantificar glutatión plasmático y, de esta manera, poder analizar las ventajas y desventajas de cada uno de ellos. Métodos La revisión fue realizada mediante la búsqueda de información en internet. Se consultaron las siguientes bases de datos digitales: Clinicalkey, Springer, PubMed, UpToDate y BVS. Dentro de estas, a fin de encontrar información de interés, se utilizaron descriptores en inglés nombrados a continuación: glutathione, determination of glutathione, oxidative stress, antioxidant therapy. Se seleccionaron documentos basándose en el abordaje de la información que éstos brindaban en función a los Figura 2. Equilibrio redox entre forma GSH y GSSG.
GSH GSSG
amino y carboxílico. El compuesto derivatizado debe proporcionar una alta sensibilidad y especificidad de detección y no debe ser susceptible a reacciones de interferencia de la matriz. El derivatizante no debería requerir pasos de extracción por solvente para eliminar el exceso de reactivo antes del análisis cromatográfico o electroforético. Dependiendo del enfoque de cada método es necesario elegir con precaución el agente derivatizante (5). Uno de los derivatizantes más utilizados es la N-etilmaleimida (NEM). Este previene la oxidación de GSH a GSSG durante el procesamiento de la muestra, y evita la subestimación de GSH y la sobrestimación de GSSG gracias a que es un potente inhibidor de GR. Sin embargo, este debe eliminarse de la muestra antes del análisis con un procedimiento que se considera bastante complejo y que requiere mucho tiempo, lo que representa una gran desventaja. A partir de la información recolectada sobre los métodos para medir glutatión se pueden diferenciar en dos grupos, los separativos; HPLC, CE y, los no separativos; espectrofotometría. A continuación, se describirán cada uno de ellos. Espectrofotometría Este método es un procedimiento enzimático sensible y específico que consta de una serie de reacciones químicas. Inicialmente, el GSH se oxida con DTNB (ácido 5,5- ditiobis (2-nitrobenzoico)), más conocido como reactivo de Ellman, para dar GSSG y TNB (ácido 5-tio- 2 - nitrobenzoico) (7). Esta reacción se mide espectrofotométricamente, en tanto que se produce TNB aumenta la absorbancia medida a 412 nm. Por lo tanto, la concentración de TNB es representativa a la suma de GSH y GSSG presente en la muestra. El GSSG formado se reduce a GSH por acción de la glutatión reductasa y NADPH. 2 GSH + DTNB GSSG + TNB GSSG + NADPH + H+^ 2 GSH + NADP+ Para cuantificar es necesario realizar una curva de calibración. A partir de estándares de concentración conocida de GSH, se registra constantemente la formación de TNB hasta un cambio de 2 o 2,5 unidades de absorbancia. Luego see grafica la absorbancia a 412 nm en función de la concentración de GSH obteniéndose una curva con una porción lineal, generalmente, entre 1 y 2 unidades de absorbancia. Cabe destacar que un blanco de muestra que carece de GSH es utilizado para determinar la tasa de GR
fondo. Los resultados obtenidos en el análisis de la muestra se extrapolan en el gráfico con el fin de obtener la concentración de GSH. Para determinar GSSG, es necesario “bloquear” GSH con NEM (N-etilmaleimida) o 2- vinilpiridina, se elimina el exceso de reactivo, aislando así el GSSG por extracción en fase sólida. El GSSG aislado se reduce a GSH por acción de la glutatión peroxidasa en presencia de NADPH (7). Lo que se mide es la absorbancia a 340 nm, la cual va a disminuir al oxidarse el NADPH que pasa a NADP +. Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC) Las columnas que se utilizan en este método pueden ser de calibre normal o estrecho. Este último permite limitar el consumo de disolvente, sin una pérdida constante de sensibilidad. La separación estándar de los compuestos derivatizados, debido a la hidrofobicidad relativamente mejorada, se realiza mediante fase reversa (RP). En los casos en los que la derivatización no se haya realizado, porque no estaba planeado hacerla o porque se va a realizar después de la separación, se utiliza RP a pesar de que la polaridad no sea la óptima. En ambos casos, la fase estacionaria más utilizada es la sílica gel de octadecil (ODS) y un eluyente con características ácidas (6). De hecho, los eluyentes buffer a pH ácido se utilizan para mejorar la interacción con la fase estacionaria. Además, los valores de pH por debajo de la neutralidad minimizan la autooxidación de los tioles. A su vez, el ácido trifluoroacético (TFA) agregado a la fase móvil resuelve las colas de picos asociadas especialmente con GSSG, funcionando como reactivo de emparejamiento de iones. Para la determinación de GSH se pueden utilizar diferentes sistemas de detección, como UV-Vis, detector de matriz de diodos (DAD), detector electroquímico (ECD) y espectrometría de masas (MS). Cromatografía de Gases (GC) Hay pocos métodos de cromatografía de gases (GC) para determinar GSH, GSSG y análogos. La detección de analitos en un sistema GC requiere la volatilización de compuestos como consecuencia de una evaporación rápida en un puerto de entrada calentado. Una vez que se encuentra en forma gaseosa es transportado por acción de la fase móvil gaseosa (no interacciona con el analito), a través de una columna capilar de metilsiloxano reticulado, hasta el detector. El que se utiliza junto con GC es un espectrómetro de masa, donde el analito será ionizado y detectado (6).
TABLA 1. Comparación de métodos analíticos. Derivatización Volumen de muestra (μL) Tiempo de análisis (min) Detector Sensibilidad Uso Costo Espectrofotometría Siempre 20 1 UV-Visible μM Fácil de usar Bajo HPLC No siempre 20 - 50 20 UV-Vis, de matriz de diodos (DAD), detector electroquímico (ECD) y espectrometría de masas puede ser nM, pmol/ml, amol/ml, fmol/ml Personal capacitado Alto GC Siempre 100 5 Espectrometría de masa detecta fácilmente en ppm y frecuentemente en ppb Fácil de usar Bajo CE No siempre 0,00 1 - 0,0 1 22 Fotométrico, fluorimétrico, electroquímico y espectrometría de masas. μM Personal capacitado Bajo
En base a la tabla expuesta, se pueden mencionar algunas ventajas y desventajas de cada una de las metodologías descriptas. En todas ellas la cantidad de muestra es relativamente poca, lo cual siempre es una ventaja al estar trabajando con muestras biológicas porque con una sola extracción basta para realizar varios ensayos. Otra ventaja común a todas las metodologías es que el tiempo de análisis no supera los treinta minutos, por ende, permite obtener resultados rápidos y llevar a cabo los análisis de una mayor cantidad de muestras por día. Asimismo, es importante destacar que, en el caso de HPLC y CE no siempre se necesita derivatizar la muestra, por lo tanto, al no hacerlo se reducen los tiempos de trabajo. En el caso de GC y espectrofotometría siempre es necesario derivatizar ya que, en el primer caso disminuye el punto de ebullición facilitando el análisis, mientras que, en el segundo, se genera un compuesto el cual presenta propiedades absortivas. En cuanto a la sensibilidad, todas las metodologías tienen una buena capacidad de detectar bajas concentraciones de analito a excepción de espectrofotometría y CE. En esta última, la sensibilidad es un poco menor ya que los volúmenes que se utilizan son muy bajos, por lo tanto, la cantidad de muestra que pasa por el detector es muy poca. En el caso de CE y HPLC se pueden utilizar variedad de detectores para analizar glutatión. Esto representa una ventaja, ya que es posible seleccionar el sistema de detección dependiendo de la disponibilidad en el laboratorio. Por el contrario, si se quiere llevar a cabo la determinación por GC es necesario contar con un detector de espectrometría de masas, el cual posee un gran valor económico. Considerando el costo económico, HPLC es la única metodología que presenta un alto costo. En el caso de CE, si bien es de bajo costo, los repuestos para el equipo son costosos. Por último, es importante tener en cuenta el conocimiento previo que se necesita a la hora de manejar un instrumental. Mientras que espectrofotometría y GC no requieren personal especializado, en CE y HPLC este es imprescindible debido a la complejidad de las metodologías, lo cual termina siendo un desventaja.
Referencias bibliográficas (1) Denzoin V, Laura A, Soraci AL, Tapia MO. Homeostasis del glutatión. Acta bioquím. clín. latinoam. [Internet]. 2013 Sep [citado 12 oct 2020]; 47(3). DOI: 5 3529349007 (2) Sastre J, Pallardo V, Viña J. Glutathione. The Handbook of Environmental Chemistry [Internet]. 2005 [citado 12 oct 2020]; Vol. (2): 91– 108. DOI: 10.1007/b (3) Moore T, Le A, Niemi AK, Kwan T, Cusmano-Ozog K, Enns GM, Cowan TM. A New LC-MS/MS. Method for the Clinical Determination of Reduced and Oxidized Glutathione from Whole Blood. Journal of Chromatography B [Internet]. 2013 jun 15 [citado 12 oct 2020]; (929): 51-55. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2013.04. (4) Mañon Rossi W, Garrido G, Núñez Sellés AJ. Biomarcadores del estrés oxidativo en la terapia antioxidante. J Pharm Pharmacogn Res [Internet]. 2016 [citado 11 oct 2020]; 4(2):62-83. DOI: 496053934003 (5) Camera E, Picardo M. Analytical methods to investigate glutathione and related compounds in biological and pathological processes. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. [Internet]. 2002 [citado 16 oct 2020]; 781(1-2):181-206. DOI: 10.1016/s1570-0232(02)00618-9. (6) Rahman I, Kode A, Biswas SK. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nat Protoc. [Internet]. 2007 [citado 23 oct 2020]; 1(6): 3159–3165. DOI:10.1038/nprot.2006. (7) Anderson ME. Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples. En: Colowick SP, Meister A, Kaplan NO. Methods in Enzymology [Internet]. Vol 113. 1era ed. Academic Press; 1985 [citado 15 de oct 2020]. p. 548-555. DOI: 10.1016/s0076-6879(85)13073-9.