BIOQUIMICA .............................., Apuntes de Análisis Molecular de ADN

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Biología molecular

Alberto Gómez Esteban 2º Medicina

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Índice de contenidos

Tema 1. Estructura y características del DNA __________________________

Tema 2. Organización del DNA: Genoma y epigenoma _________________

Tema 3. Replicación ______________________________________________

Tema 4. Transcripción ____________________________________________

Tema 5. Traducción ______________________________________________

Tema 6. Regulación de la expresión génica ___________________________

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Un nucleótido se forma al establecerse un enlace éster fosfórico el cual se produce entre un fosfato y el C^5 ’ de la pentosa.

Nomenclatura de nucleótidos : Adenilato (A), Citilidato (C), Guanilidato (G), Timidilidato (T), Uridilidato (U).

Los nucleótidos también pueden estar en sus formas di y trifosforilados. Estos nucleótidos fosforilados sirven de vector energético y como monómeros de las cadenas de DNA y RNA.

Los nucleótidos polimerizan mediante uniones que se conocen como enlaces fosfodiéster que se lleva a cabo mediante carbonos 3’-5’. El primer nucleótido deja libre su carbono 5’ y el ultimo su carbono 3’ de forma que afirmamos que la dirección de síntesis es 5’ →→→→ 3’.

Generalidades del DNA

Función

La función del DNA es la de almacenar la información genética , lo que sirve para programar en el tiempo y el espacio la biosíntesis de componentes celulares , es decir, cuando la célula necesite una proteína, el DNA se encargara de promover su fabricación. También define la individualidad de cada organismo.

Composición

− Su azúcar es la desoxirribosa

− Sus bases nitrogenadas son Adenina, Guanina, Citosina y Timina.

− Tiene gran tamaño (109 Daltons)

− No es una molécula lineal aislada, sino que es bicatenaria en forma de doble hélice con giro dextrógiro

Claves estructurales

 Composición 1-1-1 (1 base – 1 fosfato – 1 azúcar)

 Se trata de una molécula anfipática. El grupo fosfato es hidrófilo mientras que las bases y el azúcar son hidrófobas y se disponen hacia el interior.

 La difracción de rayos X ayudó a establecer el modelo de doble hélice.

 Un análisis químico nos aporta que hay el mismo numero de purinas que de pirimidinas , también nos informa de que el apareamiento es (A - T / G - C).

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 Las dos cadenas son antiparalelas (5’ – 3’ se aparea con 3’ – 5’) y se aparean mediante puentes de hidrogeno entre bases complementarias.

− Timina aparea con Adenina mediante 2 puentes de hidrógeno (A=T)

− Citosina aparea con Guanina mediante 3 puentes de hidrógeno (C≡G)

Estructura

Hacia el interior del DNA quedan las partes mas apolares (BN + pentosa)

El diámetro de la doble hélice es de 2 nm en toda su longitud. Entre dos pares de bases en la escalera hay 0,34 nm y un desfase de 36º.

El desfase de 36º causa que cada vuelta de hélice (360º) contenga 10 pares de bases, así pues, la distancia entre una vuelta de hélice y la siguiente es de 34 nm.

Hay un surco mayor y un surco menor. Estas zonas son importantes, ya que en algunas zonas del surco mayor existen interacciones con proteínas, con función reguladora promotora de genes.

Los surcos surgen ante la siguiente estructura química del DNA:

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Propiedades

El DNA se trata de un ácido muy cargado negativamente ( polianión ) debido a los fosfatos presentes en su estructura. Esta característica hace que pueda interaccionar con cationes como magnesio (Mg), calcio (Ca) y en condiciones patológicas por ejemplo puede interaccionar con plomo (Pb).

También puede interaccionar con proteínas básicas como las histonas, encargadas de estabilizar su plegamiento en el núcleo. Al interaccionar con cargas positivas que neutralizan sus cargas negativas el DNA se pliega.

Es una molécula muy estable debido a sus numerosos puentes de hidrógeno establecidos cada par de bases. Los DNA mas estables son los más ricos en citosina y guanina debido a que entre estas bases se establece triple enlace, a pesar de ello los DNA de organismos superiores no son especialmente ricos en C y G por lo que son más inestables.

Es una estructura de tipo cooperativo debido a los mencionados puentes de hidrógeno, y a las interacciones hidrofóbicas establecidas entre bases contiguas de una misma hebra.

El DNA tiene una alta viscosidad debido a que se trata de una estructura muy alargada y de elevado peso molecular. El DNA por tanto cuando se pliega disminuye su viscosidad debido a que se compacta.

Una importante característica es que absorbe luz a 260 nm , debido a sus bases nitrogenadas. Las bases nitrogenadas libres absorben mas luz que aquellas que forman parte del DNA debido a que la organización estructural interfiere en la absorción de luminosidad. Esto ayuda a detectar si el DNA esté en estructura nativa o desnaturalizado. A la mayor absorción de luz del DNA desnaturalizado se denomina “ efecto hipercrómico ”.

Decimos que un DNA esta desnaturalizado cuando ha perdido la estructura duplohelicoidal nativa. Se produce en los siguientes pasos:

1. DNA duplohelicoidal nativo
2. Se produce una perturbación que provoca una desnaturalización local
3. DNA monocatenario desnaturalizado

Si el DNA es una estructura cooperativa, los primeros pasos para la desnaturalización local son muy lentos, pero a partir de ahí, una vez producidos la desnaturalización se da muy rápidamente. Los agentes desnaturalizantes son los siguientes entre otros:

Calor. El calor aumenta la vibración de las moléculas, y desestabiliza los puentes de hidrógeno lo que causa la separación de ambas hebras.

pH extremos. Ioniza los grupos funcionales de las bases nitrogenadas lo que causa la ruptura de los puentes de hidrógeno.

Variación de la fuerza iónica

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Agentes desnaturalizantes. Como detergentes, urea, etc…

La desnaturalización del DNA se realiza mediante la “ curva de fusión ” que enuncia que al principio es difícil la desnaturalización, pero una vez se inicia la desnaturalización esta se realiza de forma prácticamente inmediata. Estas curvas de fusión se construyen midiendo la absorbancia del DNA con respecto al tiempo una vez se realiza la perturbación.

Definimos la Tm ( temperatura de fusión o desnaturalización ) como la temperatura a la que se desnaturaliza la mitad del DNA (50%). Esta temperatura depende inicialmente del medio, y una vez fijado éste, únicamente dependerá de la proporción de A/T y C/G presentes en el DNA debido a la diferencia de estabilidad de los puentes de hidrógeno entre ambos tipos de bases.

Mientras que las proteínas una vez desnaturalizadas, teóricamente son renaturalizables pero es muy difícil revertir esta desnaturalización, en cambio el DNA es posible prácticamente siempre de renaturalizar.

El proceso de renaturalización del DNA comienza de forma lenta pero se lleva a cabo de forma muy rápida una vez iniciada, y se suele hacer con frío.

Este proceso es muy importante debido a que nos ayuda a conocer la similitud entre dos DNA de distinto origen, es decir:

a. Tenemos dos hebras de DNA muy diferentes , si las desnaturalizamos y renaturalizamos dispondremos de las mismas hebras (no se aparean entre hebras de distinto origen, es decir, no se produce hibridación)

b. Tenemos dos hebras de DNA de procedencias distintas pero muy similares , si desnaturalizamos y renaturalizamos dispondremos de hebras hibridadas, o mezcladas.

Esto ayuda a diagnosticar ciertas enfermedades genéticas al comparar genes potencialmente patológicos con los de personas sanas.

Superenrrollamiento del DNA

Con la estructura de doble hélice desplegada, el DNA no cabria en la célula, por lo que se debe compactar mucho más para caber dentro de las células. La estructura más común es lo que se denomina DNA superenrrollado y se da en organismos procariotas.

1 er^ Parcial denominado nucleosoma , que consta de unos 200 pares de bases de DNA y contiene además:

− 2x ( H2A, H2B, H3, H4 )

− 1x H

Se denomina también fibra de 10 nm. Se compone por un “ core ” o núcleo de DNA unido a histonas y una fibra de DNA desnudo llamado “ linker ” o espaciador.

El core nucleosomal esta formado por un tetrámero de histonas H3 y H4 y dos dímeros de H2A y H2B estructura completa que se denomina como octámero de histonas. El DNA rodea esta estructura por fuera de la misma interaccionando con las cargas positivas de las histonas, realizando un arrollamiento levógiro equivalente al superenrrollamiento negativo de las bacterias.

La histona H1 se coloca interaccionando con el DNA de fuera cerrando esa estructura para estabilizar de forma definitiva el superenrrollamiento.

Este tipo de estructura en nucleosoma es aun insuficiente para que el DNA quepa en la célula, por lo que es preciso otro nivel superior de compactación conocido como solenoide o fibra de 30 nm , lo cual se forma cuando esta estructura nucleosomal se arrolla en torno a un eje imaginario formando una estructura helicoidal con unos 6 nucleosomas por vuelta.

Para la estructura de solenoide se precisan PNH.

Los grados de compactación a partir del solenoide no se conocen con detalle.

DNA mitocondrial

La mayor parte del DNA en los organismos eucarióticos se encuentra en el núcleo, pero una pequeña parte de este DNA se localiza en las mitocondrias.

El DNA mitocondrial es más pequeño con 16.569 pares de bases y es completamente diferente del nuclear, ya que es circular y cerrado , muy similar al bacteriano y con escasas interacciones con proteínas

Suele haber entre 3 y 10 moléculas de DNA por mitocondria, y tiene también muy pocos genes (sobre 37) que codifican diferentes RNA mitocondriales y toda una serie de proteínas las cuales en su mayoría pertenecen a la cadena respiratoria.

Este DNA es muy importante ya que variaciones en algunos genes pueden producir patologías importantes, en general de tipo neurológico (p.e. Parkinson, distonía…)

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Estructura y características de los RNA

Los RNA se sintetizan a partir de una secuencia de DNA y tenemos tres tipos principales:

− RNA mensajero (mRNA). Tiene función en la síntesis de proteínas. Representa aproximadamente el 5% del RNA. Es muy inestable

− RNA transferente (tRNA). Tiene función en la síntesis de proteínas. Representa aproximadamente el 15% del RNA

− RNA ribosómico (rRNA). Tiene función estructural en la formación de ribosomas. Representa aproximadamente el 80% del RNA

A diferencia del DNA los RNA están localizados en el citoplasma, la parte mayoritaria en ribosomas, otra parte circulante por el citoplasma, y la mínima parte en el núcleo.

Los eucariotas, concretamente los animales en la mayor parte de las tienen mucha mas cantidad de RNA que de DNA (8:2), aunque depende de su síntesis de proteínas. En aquellas células que sintetizan muchas proteínas esta diferencia es muy marcada, pero en otras células como las musculares la proporción es más baja.

El RNA suele ser monocatenario , apareciendo bicatenario solo en algunos virus.

Las diferencias con el DNA son:

Composición de bases. La mayor parte de los RNA tienen uracilo en vez de timina.

Pentosa. Ribosa en lugar de desoxirribosa.

Longitud. Las longitudes del RNA son mucho mas variables que el DNA aunque siempre más pequeñas (65 a miles de nucleótidos)

Estructura. Al ser monocatenarios no necesitan complementariedad de bases, pero es frecuente que aparezcan estructuras complementarias en una misma cadena de RNA, lo que causa la existencia de tramos en horquilla.

En estas estructuras la zona apareada se denomina brazo y la zona desapareada se llama bucle. Esta estructura se suele presentar en aproximadamente un 50% de la cadena de RNA.

1 er^ Parcial El RNA de eucariotas suele ser monocistrónico , es decir, contiene un solo gen por fragmento, aunque estos genes están entrecortados por secuencias inservibles. Los extremos 5’ y 3’ están protegidos en todos los mRNA eucarióticos.

El extremo 5’ tiene lo que denominamos CAP ó caperuza , que es una estructura que sirve para proteger el 5’ debido a que no es reconocido por nucleasas, y tiene una participación directa en la síntesis.

El CAP es un nucleótido raro con ciertas características anormales:

Se trata de un nucleótido unido a otro mediante un enlace 5’-5’ , en lugar de la unión típica 5’-3’

En la unión entre ambos nucleótidos existen tres fosfatos en vez del uno habitual

La base nitrogenada del último nucleótido (de la unión 5’-5’) es una guanina modificada ( 7-metilguanina )

En el fin de la secuencia génica existe una cola de adeninas ( secuencia poli- A ) que tiene entre 100-200 adeninas lo que protege el extremo final de las nucleasas, retrasando su llegada a la parte codificante.

La cola poli-A también estabiliza el mRNA y regula su salida del núcleo.

Respecto a la estructura del mRNA no presenta apenas estructura doblehelicoidal, debido a que es una molécula que no suele permanecer mucho tiempo en la célula.

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RNA de transferencia

Sirve para formar el complejo aminoacil-RNA y activar un aminoácido específico para su incorporación a una proteína.

Tienen una zona complementaria al codón del mensajero que se denomina anticodón , interacciona con el codón para participar en la síntesis de proteínas.

Si los tRNA son específicos de los aminoácidos deberían existir alrededor de 20 tipos, pero realmente en las células existen unas 60 moléculas distintas de tRNA debido a que la mayoría de los aminoácidos tienen varios tRNA específicos (DNA degenerado). Los tRNA que se unen al mismo aminoácido se denominan isoaceptores y se representan como tRNAaminoácido

El tamaño de los tRNA es de unos 75-80 nucleótidos, muy parecido en todas las moléculas.

Los tRNA tienen múltiples bases diferentes de las normales, lo que se denomina “bases raras”. De los 75 nucleótidos que tienen aproximadamente 10 son bases raras. Las más frecuentes son:

Timina/T (ribotimidina). Ya que es exclusiva del DNA.

Dihidrouracilo/DHU (dihidrouridina). Es un uracilo con su doble enlace saturado.

Hipoxantina/Hx (inosina)

Uracilo/ ψψψψ (Pseudouridina). Se une de forma anormal a la ribosa

Bases metiladas

La función de estas bases no se conoce. Sobre todo en el caso de la hipoxantina que aparece muchos casos en el anticodón. La hipoxantina no tiene interacción correcta con el codón al carecer de base complementaria. Esto causa que la unión sea inestable, lo que aumenta la velocidad de la síntesis proteica al promover la rápida separación del codón-anticodón, y el reconocimiento de dos bases del codón es suficiente para la síntesis proteica.

Los tRNA suelen tener alta proporción de estructura doblehelicoidal , teniendo una estructura en forma de hoja de trébol (tres estructuras tipo horquilla) con aproximadamente un 50% de estructura helicoidal.

Todos los tRNA que se conocen tienen en el extremo 5’ una guanina fosforilada y en el extremo 3’ desapareado tienen todos la secuencia ACC. Este extremo 3’ es el que interacciona con el aminoácido, por lo que se denomina brazo aceptor del aminoácido.

1 er^ Parcial La estructura terciaria del tRNA tiene forma de L invertida.

En el extremo superior se encuentra el brazo aceptor del aminoácido

En el extremo inferior contiene al núcleo anticodón

El costado superior de la L es el bucle T ψψψψ C

El costado lateral izquierdo contiene el bucle DHU. A partir de este bucle interacciona con la enzima necesaria para catalizar la unión aminoacil-RNA.

RNA ribosómico

Se trata de un rRNA que presenta 3 especies distintas en procariotas y 4 especies distintas en eucariotas.

Los procariotas tienen:

− Subunidad grande del ribosoma (50 S)

rRNA 5S
rRNA 23S
36 proteínas − Subunidad pequeña del ribosoma (30 S)

rRNA 16 S
21 proteínas

1 er^ Parcial En los eucariotas en cambio los ribosomas tienen la siguiente conformación:

− Subunidad grande (60 S)

rRNA 5 S

rRNA 5,8 S

rRNA 28 S

∼ 49 proteínas

− Subunidad pequeña (40 S)

rRNA 18 S (^)
∼ 33 proteínas

Aproximadamente el 50% del rRNA tiene estructura doblehelicoidal de manera similar al tRNA.

La función es fundamentalmente estructural, en la conformación del ribosoma, pero también participan directamente en la traducción para la síntesis de proteínas, fundamentalmente el de la subunidad menor.

Otros RNA

− snRNA ( RNA pequeños nucleares ). Son una serie de RNA de pequeño tamaño muy ricos en uracilo (se nombran como U 1 , U 2 …) y tienen un papel fundamental en las transformaciones que tienen que sufrir los RNA desde que se forman hasta que son funcionales.

Son más importantes en procariotas que en eucariotas.

− Mitocondriales. La mitocondria tiene RNA diferentes que el resto de la célula. Los ribosómicos son más similares a los bacterianos que a los citoplasmáticos

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Configuración del DNA

DNA de copia única

El DNA de copia única puede representar entre el 50-70% (en humanos un 70%) del total de material genético. El DNA de copia única está compuesto en una pequeña parte (alrededor de un x%) por los genes o secuencias codificantes, y una mayoría de DNA no codificante.

El DNA no codificante incluye los intrones, los cuales son el DNA que entrecorta los fragmentos codificantes de los genes (se considera que los intrones forman parte del gen, pero que no codifica proteína).

DNA repetitivo

El DNA repetitivo no es más que secuencias de DNA que se repiten muchas veces a lo largo del genoma, desde algunos cientos de veces hasta incluso 106 veces representando entre el 20-50% (30% en humanos) del total de material genético. Podemos separar al DNA repetitivo en DNA codificante y DNA no codificante. El DNA codificante puede estar agrupado en regiones concretas del DNA o bien disperso.

El DNA repetitivo codificante y agrupado se compone de genes que codifican proteínas o RNA pero que a diferencia de los anteriores que aparecen en copia única, éstos aparecen en múltiples copias a lo largo del genoma.

La mayor parte de las proteínas vienen codificadas por un gen de copia única, pero hay algunas que disponen de muchas copias y las expresan todas, de manera que estos genes repetitivos aparecen en zonas concretas del DNA y que codifican o bien proteínas o bien RNA.

Pueden agruparse en múltiples familias:

− Familias génicas clásicas con secuencias repetidas en tándem (p.e. genes de las histonas). En humanos se considera que existen 40-50 copias pero pueden llegar a tener unas 100 copias. Todas las copias son prácticamente idénticas y todas se expresan. También responden a este esquema los genes de los rRNA más grandes y genes de los tRNA.

Los genes no contienen solo una parte estructural codificante para proteínas sino también contienen una región reguladora.

Los genes están compuestos por exones e intrones (zona estructural) y una región reguladora.

1 er^ Parcial − Familias multigénicas con genes agrupados (p.e. genes de las globinas o genes de los antígenos de histocompatibilidad). Estas copias no son exactamente iguales, sino que codifican proteínas ligeramente distintas las cuales se expresan unas u otras dependiendo de la etapa vital, es decir, estos genes no se expresan todos a la vez.

Algunos de estas zonas presentan genes, pseudogenes (no se expresan nunca debido a que han mutado), genes truncados o fragmentos génicos.

− Familias multigénicas con genes dispersos. Presentan múltiples copias por todo el genoma pero distribuidas en distintas zonas del DNA o incluso distintos cromosomas.

DNA no codificante

El DNA no codificante también se puede presentar agrupado o disperso.

El DNA repetitivo agrupado es un DNA que aparece desde varios miles de veces en el DNA a incluso 1,5 millones de veces (DNA altamente repetitivo). También podemos decir que aparecen en regiones heterocromáticas. Aparece siempre en repeticiones y generalmente es denominado DNA satélite.

Las secuencias no suelen ser largas (20-30 pares de bases). Es un DNA muy rico en adenina-timina , y si se lisa y se centrifuga, tiene menor densidad que otras clases de DNA debido a su menor cantidad de puentes de hidrógeno

En humanos se conocen 6 secuencias satélites con estas características, los cuales se localizan principalmente en los centrómeros , y su función es desconocida (aunque se postula su implicación en la división celular). Uno de los seis tipos de satélites se sitúa también en los telómeros.

El DNA moderadamente repetitivo se trata de DNA no codificante, disperso y se repite en general menos que el satélite.

Distinguimos desde aquel que aparece disperso por todo el genoma en bloques repetidos en tándem (DNA minisatélite y microsatélite).

Minisatélites. Repeticiones de cientos a miles de veces. Tienen unos 10-65 pb. Aparecen localizados fundamentalmente en los telómeros y se encargan de estabilizar esta zona del DNA.

Normalmente cuando el DNA se fragmenta, se centrifuga en una disolución cuya densidad aumenta hacia abajo, y el DNA fragmentado se coloca en la parte superior.

Ese DNA al ser centrifugado va separándose en partes de distinta densidad. Los DNA ricos en A-T se sitúan más arriba que aquellos en G-C.