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Un procedimiento práctico para la determinación de cafeína en muestras utilizando la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (hplc). Se explica el proceso de preparación de la muestra, la configuración del equipo hplc, la obtención y análisis de los cromatogramas, y la interpretación de los resultados. El documento también incluye información sobre las propiedades fisicoquímicas de la cafeína y las consideraciones teóricas relevantes para la técnica de hplc.
Typology: Cheat Sheet
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Objetivos ʘ Inyectar diferentes cantidades de analito para observar cómo afecta las respuestas del HPCL. ʘ Realizar una curva de calibración con los datos obtenidos. ʘ Cuantificar un analito en una muestra problema. Consideraciones teóricas Propiedades fisicoquímicas de la cafeína. (1,3,7- trimetilxantina) Formula: Peso molecular:
194.19 g/mol Estado físico: Color: Polvo cristalino Incoloro ( blanco) Densidad Posibles reacciones violentas con:
inevitable, pero puede ser controlado por medio de variables como son la teoría cinética de la cromatografía, la cual de explica las formas y anchos de las bandas de elución en términos cuantitativos con base en un mecanismo de avance aleatorio para la migración de las moléculas a través de la columna, el ensanchamiento de una zona aumenta a medida que desciende por la columna, por que ha habido mas tiempo para que haya dispersión, entonces el ensanchamiento de la zona esta relacionado de manera directa con el tiempo de residencia e inversamente proporcional al flujo de la fase móvil, el diámetro de las partículas que constituyen el relleno de la columna, o el diámetro de la columna en el caso de columnas abiertas, razón por la cual en los últimos años se ha implementado el uso de columnas cada vez más angostas, tiene también una gran influencia la altura del plato, sin embargo este tipo de análisis resulta no muy apropiado, pues cuando se realizo este estudio fue haciendo analogía a la destilación, por lo que perpetua la idea de que existen platos dentro de la columna cromatográfica, de manera general se considera mejor el
rendimiento de la columna al poseer mas platos de menor altura. Así también es importante resaltar que algunos picos cromatográficos nos son ideales, pues presentan deformaciones hacia la cola (derecha) o el frente (izquierda) de estos, dichas deformaciones generalmente ocurren por que se ha introducido demasiada muestra en la columna, y son indeseables debido a que ocasiones separaciones deficientes y a tiempos de elución menos reproducibles. Para mejorar una separación cromatográfica, se deben variar las condiciones experimentales hasta que los componentes de la mezcla se separen con claridad en el menor tiempo posible, lo cual se logra de dos formas, reduciendo el ensanchamiento de banda, o bien modificando las velocidades relativas de migración de cada uno de los componentes. Procedimiento experimental En esta, así como en todas las practicas posteriores será necesario
Posteriormente será necesaria la creación, carga o modificación de un método, para la cual es necesario que en el software “chromera” ubiquemos el botón denominado como “ method ”, el cual esta señalado por la flecha en la siguiente imagen. Así también tras haber seleccionado la opción de método, en la pestaña llamada “ file ”, encontraremos la opción de crear un nuevo método, modificar o cargar uno ya existente, donde se incluyen parámetros como el nombre, la carpeta en donde guardaremos el método, una breve descripción y las notas que consideremos pertinentes respecto a las condiciones y parámetros en que se llevara a cabo el método y el porqué de estos.
Seleccionamos el método con el nombre de “cafeína” del grupo que nos interesa en este caso el grupo denominado “Camacho” y procedemos a verificar que los parámetros que se establecen en este son apropiados para el experimento que se esta llevando a cabo. Tras acceder al metodo visualizaremos la siguiente pantalla, donde se muestran el nombre, grupo,
Despues de la configuracion del detector es necesario configurar la bomba, para que esta trabaje con la misma composición de la fase movil (isocratica) o con gradiente, es decir variando la composicion durante el tiempo de la experimentación. Tambien puede considerar el timepo de equilibrio, las presiones minimas y máximas a las que puede llegar el equipo, es posible configurar más de un evento a la bomba, sin embargo en este caso no es necesario, por lo que se visualiza la pantalla con la siguiente información:
Para acceder al cromatograma obtenido por el software “chromera” en la pantalla hacemos clik sobre la pestaña de
nombre “ reports ”, donde seleccionaremos el que necesitamos, y obtenemos la siguiente información: De la cual nos interesa únicamente el pico de la cafeína, el cual tiene aproximadamente 3.3 minutos de tiempo de retención. Tras realizar la experimentación es necesario apagar el equipo, lo cual se hace de la misma manera en que fue descrito en la práctica anterior. Datos experimentales Concentració n 𝒎𝒈 𝑳
[minuto s]
[uA.s ]
[uA] 15 3.
muestra, información que se puede ver reflejada en las siguientes gráficas. De la regresión lineal planteada con la altura del pico se obtiene una pendiente de 𝑚 = 5 133. 1 𝑢𝐴 ( 𝑚𝑔 𝐿 ) y 𝑏 = 0 𝑢𝐴. Mientas que de la regresión lineal planteada con las áreas se obtienen y = 5133.1x R² = 0. 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 0 10 20 30 40 50 60 Altura del pico [uA] concentración [mg/L] y = 42045x R² = 0. 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 0 10 20 30 40 50 60 Area [uA.s] concentración [mg/L]
valores de pendiente de 𝑚 = 42 045 𝑢𝐴 ( 𝑚𝑔 𝐿 )
Cálculos Despejando de la ecuación obtenida con el uso de la altura del pico 𝑦 = 5 133. 1 𝑿 ∴ 𝑿 =
Despejando de la ecuación obtenida con el uso del área del pico 𝑦 = 42 045 𝑿 ∴ 𝑿 =
Análisis de resultados Se esperaba que el tiempo de retención tuviera un ligero aumento a medida que la concentración de la muestra era mayor, sin embargo, esto
la velocidad del eluyente en la columna y la velocidad de carga de la muestra, ya que con ellos se evita el ensanchamiento de la banda y por consiguiente la variación de su altura del pico, causando errores de aproximadamente el 5 hasta 10%.
