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Medicina & Laboratorio, Volumen 14, Números 3-4, 2008
Hematología
¿Cómo obtener un extendido
de sangre periférica de óptima calidad?
Germán Campuzano Maya 1
“La calidad de un resultado de laboratorio depende de la calidad de la muestra” (premisa básica de las buenas prácticas de laboratorio)
Resumen: a pesar de los grandes avances tecnológicos y el desarrollo de nuevos parámetros en hematología, el extendido de sangre periférica continúa siendo la “prueba reina” en el diagnóstico de las enfermedades hematológicas. Por razones ajenas al objetivo de este módulo, y a la mala utilización de la tecnología, entre otras razones, muchos laboratorios clínicos han menospreciado el valor del extendido de sangre periférica y en consecuencia sólo se limitan a entregar como resultado, el informe “en bruto” que entrega el autoanalizador de hematología, sin el más mínimo análisis del extendido de sangre periférica, aun en los casos en donde las alarmas del instrumento así lo exigen, dentro del marco de las buenas prácticas de laboratorio. Para tener un estudio de la morfología de la sangre periférica que pueda ser considerado de óptima calidad, calificación que siempre será posible, necesariamente deberán confluir tres condiciones: (1) que el extendido de sangre periférica sea óptimo, (2) que la coloración sea óptima y (3) que la placa sea analizada por personal idóneo.
Palabras claves: extendido de sangre periférica, método del portaobjeto, método de laminilla.
Campuzano-Maya, G. ¿Cómo obtener un extendido de sangre periférica de óptima calidad? Medicina & Laboratorio 2008, 14: 125-152.
Módulo 4 (Hematología), número 9. Editora Médica Colombiana S.A., 2008 ®
Recibido el 22 de enero, 2008; aceptado el 18 de febrero, 2008.
D
esde 1956, cuando Wallance Coulter inventó el primer contador de células [1], el he- mograma como prueba de laboratorio no ha cesado de evolucionar y como resultado ha traído mejoras y también problemas. Con respecto a las primeras, los contadores no sólo han permitido tener resultados tan exactos como impensables con los métodos manuales [2], sino que han aportado, sobre todo los de las últimas generaciones, nuevos parámetros de valiosa utilidad clínica y excelente relación costo beneficio para el paciente y los sistemas de seguridad social [3-8]. Con respecto a los segundos, el hemograma, a pesar de que es una de las pruebas más solicitadas al laboratorio clínico, por razones ajenas a las de este módulo, a la falta de educación continua y a un entrenamiento adecuado en el manejo de estos instrumentos y de los nuevos parámetros, infortunadamente se ha utilizado inadecuadamente, como se analizará más adelante.
- Médico especialista en Hematología y Patología Clínica. Profesor Ad Honorem , Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia. Médico Director, Laboratorio Clínico Hematológico S.A. Medellín, Colombia. Correspondencia: Carrera 43C No. 5-33, Medellín, Colombia. E-mail: gcampuzano@hematologico.com
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El objetivo de este módulo es múltiple: (1) llamar la atención sobre el mal uso de los autoa- nalizadores de hematología, (2) presentar a los profesionales del laboratorio clínico las diferentes opciones de manejo del hemograma electrónico y en particular lo relacionado con el extendido de sangre periférica, como parte integral del hemograma y (3) presentar a la comunidad de usua- rios, los médicos, las posibilidades que con respecto al diagnóstico hematológico les proveen los avances tecnológicos cuando se utilizan adecuadamente, acorde con los estándares de calidad [9] y la forma cómo los resultados les deben ser informados, de tal manera que sea la verdadera ayuda que realmente es la prueba y no motivo de confusión, como está sucediendo en muchos casos.
¿Qué está sucediendo con el hemograma y el extendido de
sangre periférica en Colombia?
A pesar de los grandes avances tecnológicos de las últimas décadas, en particular los rela- cionados con el diagnóstico hematológico gracias a la incorporación de los autoanalizadores de hematología en la mayoría de los laboratorios clínicos, no sólo se han mejorado sustancialmente los parámetros convencionales del hemograma sino que se han introducido nuevos parámetros de utilidad clínica, como recientemente se analizó en un módulo anterior en MEDiCiNA & LA- boRAtoRio [10].
Infortunadamente, como resultado de la automatización, y por otras razones que no son ob- jeto de este módulo, el estudio de la sangre periférica ha pasado a un segundo plano, llegando a no hacerse en muchos laboratorios clínicos, como claramente se deduce de los facsímiles de informes del hemograma que se reproducen en las figuras 1 a 3 , y cuando los hacen, su calidad es tan pobre, como se analizará más adelante, que no es posible tener un buen estudio de san- gre periférica, olvidando que “los contadores de células son excelentes pero no perfectos” [11] y en ningún momento pueden reemplazar a un detenido y cuidadoso estudio de un extendido de sangre periférica. Como se observa en los citados informes, algunos de ellos procedentes de laboratorios clínicos de diferentes partes del país, que se comportan como “fábricas de exáme- nes”, no sólo se ha excluido el extendido de sangre periférica, sino que entrega el resultado “en bruto”, tal y como sale de la máquina, en muchos casos en inglés y en unidades no utilizadas en el medio, sin la más mínima revisión y análisis microscópico del extendido de sangre periférica, aun cuando el instrumento muestra alarmas que así lo exigen dentro de las buenas prácticas de laboratorio. Los laboratorios clínicos que así proceden pareciera que desconocen el papel del laboratorio clínico en el acto médico y olvidan que la solicitud de un prueba de laboratorio es una interconsulta más que “una orden comercial para hacer un examen” [12-15].
De acuerdo con la metodología utilizada y los parámetros que lo componen, en el medio se reconocen seis tipos de hemogramas, debidamente codificados y definidos por la Sociedad Co- lombiana de Patología Clínica [16] que coinciden en su mayoría con los definidos por el Colegio Americano de Patólogos, que a su vez, son reconocidos por la Asociación Médica Americana y el Colegio Americano de Patólogos [17] y han sido acogidos por el Ministerio de Protección Social de Colombia como base de los manuales de contenidos de los planes de salud (CUPS) [18], con excepción de los hemogramas tipo V y VI, recientemente incorporados a los laboratorios clínicos del país. Desde el punto de vista práctico, los hemogramas se subdividen en dos grandes grupos: (1) los hemogramas manuales, que corresponden a los tipos I y II y (2) los hemogramas electró- nicos derivados de los autoanalizadores de hematología, que corresponden a los tipos III, IV, V y VI [19].
Todos los hemogramas del tipo IV a VI, además de los valores cuantitativos propios de cada uno de ellos, generan una serie de gráficos conocidos como histogramas, dispersogramas y ci- togramas en los cuales se presentan gráficamente algunos de los aspectos más importantes de
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autoanalizador, (3) permiten identificar las posibles causas relacionadas con resultados erróneos generados por los autoanalizadores, y (4) le permiten al examinador presumir un determinado diagnóstico [20]. Al médico le debe llegar el informe del hemograma tan claro como sea posible, muy similar al facsímil del informe de un hemograma tipo VI que se reproduce en la figura 4 (la hoja de trabajo) y en la figura 5 (el informe final del hemograma).
¿Cuándo hacer o solicitar un estudio del extendido de sangre
periférica?
Hacer o no hacer extendido de sangre periférica como parte integral del hemograma de- pende del método utilizado para hacerlo y de las necesidades del médico, siempre en un deter- minado contexto clínico. Se dan dos situaciones en particular: los hemogramas manuales y los hemogramas electrónicos.
Figura 2. Facsímil de un informe de un hemograma tipo iV. Como en el caso anterior, el laboratorio clínico se limitó a en- tregar al paciente el informe tal cual sale del instrumento, en inglés y con los parámetros en siglas. De acuerdo con lo que se observa en el informe hay una anemia señalada con múltiples asteriscos, un recuento diferencial de tres partes con un asterisco que llama la atención sobre la presencia de “linfocitos reactivos”. Además en la parte lateral derecha se ha pegado al informe la tirilla del instrumento y si se mira con detenimiento, los valores de la tirilla han sido transferidos a la “hoja de informe”. De acuerdo con esta metodología, en este hemograma que corresponde al tipo iV en donde el recuento diferen- cial de leucocitos convencional (de cinco partes que incluye polimorfonucleares neutrófilos, polimorfonucleares eosinófilos, polimorfonucleares basófilos, linfocitos y monocitos), debe hacerse manualmente y las alarmas relacionadas con la anemia y la linfocitosis habrían sido indicación para un estudio completo del extendido de sangre periférica, que no se evidencia en este informe. Además, llama la atención de un término ajeno al laboratorio clínico estándar o a la hematología como es “recuento diferencial de células mixtas”. Es claro que este tipo de hemogramas, por lo menos de informe, desorienta más que cumple con su objetivo como prueba de laboratorio. Fuente: historia clínica de un paciente de la consulta del autor.
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Figura 3. Facsímil de un informe de un hemograma tipo V. Como en el caso anterior, el laboratorio clínico se limitó a en- tregar al paciente el informe tal como sale del instrumento, en inglés y con los parámetros en siglas. De acuerdo con las alarmas L, H y “ thrombocytopenia ” de 12.000 plaquetas por μL, claramente debía haber sido completado con un estudio del extendido de sangre periférica que obviamente no se realizó en este paciente como se evidencia en este informe. Fuente: historia clínica de un paciente de la consulta del autor.
Hemograma manual
Como su nombre lo indica, en los hemogramas tipo I y II, de acuerdo con la Sociedad Co- lombiana de Patología Clínica [19] y el Ministerio de Protección Social [18], acorde con los estándares internacionales y las buenas prácticas de laboratorio, los parámetros cuantitativos se determinan por instrumentación básica, en particular con pipetas y cámara de Neubauer [10], y los parámetros cualitativos y el recuento diferencial de leucocitos se derivan, en todos los casos, del estudio del extendido de sangre periférica realizado por profesionales debidamente capaci- tados para ello [21, 22].
Hemograma electrónico
En los hemogramas electrónicos o derivados de los autoanalizadores de hematología, el es- tudio del extendido de sangre periférica depende del tipo de hemograma y de los resultados de éste, como se analizará a continuación.
Hemograma tipo III
En los hemogramas tipo III, de acuerdo con la Sociedad Colombiana de Patología Clínica [19] y el Ministerio de Protección Social [18], el instrumento entrega los parámetros básicos como la hemoglobina, el hematocrito, el recuento de eritrocitos, los índices eritrocitarios (volumen cor-
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Figura 5. Facsímil de un informe de un hemograma tipo Vi. Se presenta el informe final de un hemograma organizado de acuerdo con los parámetros analizados y completamente transparentes para el médico. Fuente: historia clínica de un paciente de la consulta del autor.
puscular medio, hemoglobina corpuscular media, concentración de la hemoglobina corpuscular media), el recuento total de leucocitos y en algunos instrumentos, como un parámetro opcional, el recuento total de plaquetas [23], pero no da ninguna información sobre la morfología de la sangre ni mucho menos sobre el recuento diferencial de leucocitos, parámetros que necesaria- mente deben ser obtenidos mediante el estudio cuidadoso del extendido de sangre periférica [21, 22].
Dentro de este grupo de autoanalizadores están, a modo de ejemplo, el Sysmex CC-700 [24], el Sysmex CC-800 [25], el Sysmex M-2000 [24], el Sysmex E-4000 [26] y el Sysmex E-5000 [27] de TOA Medical Electronics, el ZF6 [28] y el Modelo S de Coulter [29, 30], el SMA-4 [31] y SMA- 4A y el H6000 [32] de Technicon [30], el Celloscope 401 [33] y el Celloscope 421 [34] y el Cell Dyn 900 [28] de Sequoia-Turner, entre otros.
Hemograma tipo IV
En los hemogramas tipo IV, de acuerdo con la Sociedad Colombiana de Patología Clínica [19] y el Ministerio de Protección Social [18], como en el caso anterior, el instrumento entrega los
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parámetros básicos como la hemoglobina, el hematocrito, el recuento de eritrocitos, los índices eritrocitarios (volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular media, concentración de la hemoglobina corpuscular media), el recuento total de leucocitos y el recuento total de plaquetas. Además, incluye nuevos parámetros como el ancho de distribución de los eritrocitos [35] y un recuento diferencial de leucocitos básico, conocido como de tres partes, debido a que agrupa los leucocitos, de acuerdo con el tamaño, en tres clases de células: linfocitos, células mixtas (en donde se incluyen monocitos, polimorfonucleares eosinófilos y polimorfonucleares basófilos) y polimorfonucleares neutrófilos [36-39]. Cuando el laboratorio clínico utiliza este tipo de autoa- nalizador de hematología debe incluir en todos los hemogramas que realiza de rutina extendidos de sangre periférica para observar la morfología de las diferentes series (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y hacer el recuento diferencial de leucocitos, esto es de cinco partes (polimorfo- nucleares neutrófilos, polimorfonucleares eosinófilos, polimorfonucleares basófilos, linfocitos y monocitos) [22].
Dentro de este grupo de autoanalizadores están, a modo de ejemplo, el Sysmex pocH-100i [40], el Sysmex CC-800 [25], el Sysmex M-2000 [24] y el E-5000 [41] de TOA Medical Electro- nics, el Hematrack [42] y el Coulter S Plus IV [36, 43] de Coulter, entre otros.
Hemograma tipo V
En los hemogramas tipo V, de acuerdo con la Sociedad Colombiana de Patología Clínica [19], como en los casos anteriores, el instrumento entrega los parámetros básicos como la hemoglo- bina, el hematocrito, el recuento de eritrocitos, los índices eritrocitarios (volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular media y concentración de la hemoglobina corpuscular media), el recuento total de leucocitos y el recuento total de plaquetas. Además, incluye nuevos paráme- tros como el ancho de distribución de los eritrocitos, el volumen medio plaquetario, el ancho de distribución de las plaquetas y el plaquetocrito, y entrega un recuento diferencial de leucocitos de cinco partes, en donde se incluyen polimorfonucleares neutrófilos, polimorfonucleares eosi- nófilos, polimorfonucleares basófilos, linfocitos y monocitos [44-46]. La ventaja de estos autoana- lizadores, con respecto a los anteriores, radica en un software robusto que mediante algoritmos, de acuerdo con los resultados y las anormalidades cuantitativas y cualitativas, clasifica los hemo- gramas en dos grandes grupos:
1. Normales, aquellos en donde el instrumento no encuentra ninguna alteración o señal de alarma y en los cuales no es necesario hacer estudio de sangre periférica complementario, a no ser que se tenga una indicación específica como la presencia de organomegalias (ade- nopatías, esplenomegalia, hepatomegalia), debido a que la sensibilidad y especificidad de los procedimientos manuales son mucho más bajas que en los hemogramas derivados de estos autoanalizadores, como claramente se ha demostrado [47, 48]. 2. Anormales, aquellos en donde el instrumento encuentra (a) alteraciones en los parámetros cuantitativos, (b) alteraciones cualitativas y (c) alteraciones cuantitativas y cualitativas, en los cuales, en todos los casos, de rutina, es necesario hacer el estudio complementario del extendido de sangre periférica [22].
Dentro de este grupo de autoanalizadores están, a modo de ejemplo, el Sysmex NE- [44, 49], el Sysmex SE-9000 [50] y el Sysmex SE-9500 [51] de TOA Medical Electronics, el MAXM [52] y el Gen-S, el STKR [53] de Coulter, el Cell-Dyn 1000 [54] y el Cell Dyn 3500 [55] de Abbott Diagnostics, y el Advia 120 [56-58] de Bayer, entre otros.
Hemograma tipo VI
En los hemogramas tipo VI, de acuerdo con la Sociedad Colombiana de Patología Clínica [19], igual que en los otros hemogramas electrónicos, el instrumento entrega los parámetros
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Pentra 120 [56] de Abx Horiba, el LH 750 [57] de Beckman Coulter, el Cell Dyn 4000 [56, 75] y el Cell Dyn Sapphire [76] de Abbott Diagnostics, entre otros.
Indicaciones para hacer el extendido de sangre periférica
desde la óptica del médico
Además de las indicaciones derivadas de la metodología que el laboratorio clínico utilice para hacer el hemograma, el estudio de sangre periférica puede ser solicitado en forma expresa por el médico en situaciones como las que se relacionan en la tabla 1 , y en estos casos es ideal que los extendidos fuesen revisados por profesionales especialmente entrenados en morfología sanguínea [77].
¿Cómo hacer un extendido de sangre periférica de óptima
calidad?
Dependiendo de las disponibilidades propias de cada región y de cada institución, que a su vez determinan la complejidad y del grado de instrumentación del laboratorio clínico, para hacer un extendido de sangre periférica se dispone de medios que van desde los métodos manuales hasta los altamente automatizados, que independiente de cual se utilice, si está bien estandari- zado puede y debe proveer un extendido de sangre periférica de óptima calidad. En la práctica, para hacer el extendido de sangre periférica se dispone de tres metodologías: la del portaobjeto, la de la laminilla y la de capas.
Método del portaobjeto
El método del portaobjeto, también conocido como método de doble portaobjeto o método en cuña, es el más utilizado universalmente para hacer los extendidos de sangre periférica. Para lograr un extendido de sangre periférica por este método es importante tener en cuenta la mues- tra, el material utilizado y el procedimiento propiamente dicho. El método del portaobjeto puede hacerse por dos métodos: manual y automatizado.
Método manual del portaobjeto
El método manual del portaobjeto es más utilizado en los laboratorios clínicos. Para hacerlo en forma adecuada deben cumplirse las siguientes condiciones:
Muestra
Se puede hacer con sangre completa obtenida por punción digital o con sangre anticoagulada con EDTA (tubo con tapa lila para hemograma) [78]. Las muestras con heparina no son adecuadas para hacer el extendido de sangre periférica porque frecuentemente forma pequeños coágulos de plaquetas que interfieren con el análisis de la morfología plaquetaria y porque interfiere con la coloración, dando una fondo azul púrpura [79].
Material
Para lograr extendidos de sangre periférica de óptima calidad es indispensable utilizar por- taobjetos de 75 x 25 x 1 mm, nuevos, de buena calidad, no los más baratos del mercado, limpios y libres de polvo y de grasa y por ningún motivo, reutilizados. Además, se requiere de portaob- jetos extensores, romos e idealmente más estrechos que los utilizados para el extendido de la sangre.
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Procedimiento
Los pasos a seguir en el método del portaobjeto para hacer el exten- dido de sangre periférica son los si- guientes:
1. Colocar el portaobjeto en don- de se planea hacer el extendi- do sobre una superficie plana, si la persona que va a hacer el procedimiento es diestra, con la gota de sangre al lado dere- cho y si es zurda, con la gota de sangre al lado izquierdo. 2. Colocar una pequeña gota, ya sea de la punción directa del dedo o del tubo con an- ticoagulante, de 2 a 3 mm de diámetro (0,05 mL), de sangre bien mezclada (10 inversiones manuales o 2 minutos en un homogenizador), a 1 cm de un extremo del portaobjetos. Si se emplean portaobjetos de extremo esmerilado o es- pacio reservado para marcarlo, la sangre se coloca cerca de éste, como se muestra en la figura 6A. 3. Con el pulgar y el índice de la mano derecha sujetar el segundo portaobjetos, también conocido como portaobjetos extensor, contra la superficie del primer portaobjeto con un ángulo de 30° a 45°, como se muestra en la figura 6B. 4. Deslizar el portaobjetos de empuje hacia atrás, hacia la gota de sangre. Permitir que la gota se extienda hasta tres cuartas partes del bisel del portaobjetos de empuje. Procurar que la sangre se extienda hasta los bordes del portaobjetos extensor, como se muestra en la figura 6C. 5. Empujar rápidamente el portaobjetos extensor hacia delante (lejos de la gota), como se muestra en la figura 6D. Este movimiento debe ser suave y continuo hasta el extremo del portaobjetos. El portaobjetos extensor deberá estar limpio y seco, e idealmente deberá ser menos ancho que el primer portaobjetos, como se visualiza en las figuras 6B , 6C y 6D , para evitar que la muestra se desborde y poder examinar con mayor facilidad los bordes en el microscopio. 6. Permitir que el extendido se seque al aire antes de colorearlo. Se puede abanicar en el aire para que se seque en menos tiempo. 7. Marcar el portaobjetos con un lápiz apropiado. La identificación debe ser en el extremo grueso (o el esmerilado) del portaobjetos.
Método automatizado del portaobjeto
Una de las características más importantes del método del portaobjeto es la posibilidad de ser automatizado. Los extendidos de sangre periférica se pueden automatizar en forma indepen-
Figura 6. Extendido de sangre periférica por el método del portaobjeto. A: colocación de la gota de sangre en el portaobjeto; b: colocación del portaobjeto extensor; C: desplazamiento del portaobjeto extensor, hacia la derecha, en búsqueda de la gota de sangre; D: desplazamiento del portaobjeto extensor hacia la izquierda para hacer el extendido de san- gre periférica.
A B
C D
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1. El extendido debe progresar desde un aspecto grueso en el punto de origen (cabeza del extendido), a un aspecto delgado, con un borde uniforme en el punto final (cola del ex- tendido). 2. El extendido en todo su trayecto no debe tocar los bordes externos del portaobjetos, ni se debe desbordar por los lados o extremos del mismo. 3. El extendido no debe tener ondas ni huecos, estrías, crestas ni depresiones, lo cual llevaría a resultados espurios, principalmente en el recuento diferencial de leucocitos. 4. Si la cantidad de sangre y la distribución de ésta son las adecuadas, el extendido debe ocupar dos tercios de la longitud del portaobjetos, esto es de 3 a 4 cm.
¿Cuáles son las causas por las cuales el extendido por el método del
portaobjeto puede ser deficiente?
Son muchas las causas por la cuales un extendido de sangre periférica puede ser deficiente para su estudio, circunstancias que los profesionales del laboratorio clínico deben controlar. Den- tro de estas circunstancias las principales son las siguientes:
1. Cuando el extendido se hace con sangre con anticoagulante (usualmente con EDTA) y la muestra se almacena por períodos prolongados (más de dos horas) [79] o en condiciones inadecuadas. Como resultado de esta circunstancia, se puede presentar distorsión celular. 2. Cuando el extendido se hace con sangre sin anticoagulante y éste no se extiende inmedia- tamente después de colocar la gota de sangre en el portaobjetos. Si este proceso se retrasa, hasta cuando se inician los procesos de coagulación, las células más grandes, como los neu- trófilos y los monocitos, se localizan de manera desproporcionada en el extremo delgado del extendido, dando resultados espurios en el recuento diferencial de leucocitos. 3. Cuando se utilizan portaobjetos sucios o de mala calidad. Los portaobjetos deben estar libres de polvo y manchas de grasa. En algunos laboratorios clínicos con buenas prácticas de laboratorio limpian con alcohol los portaobjetos para hacer los extendidos de sangre periférica de rutina. 4. Cuando el tamaño de la gota de sangre es inapropiado. Una gota demasiado grande produ- ce un extendido grueso y largo. Una gota demasiado pequeña produce un extendido delgado y corto, insuficiente para un estudio adecuado. 5. Cuando el ángulo del portaob- jetos de empuje es incorrecto. Mientras menor sea el ángulo del portaobjetos de empuje, el
Figura 8. Aditamento incorporado a un autoanalizador de hematología, XE-Alpha®^ (XE-2100/sp-1000i) de Sysmex, para el extendido y colora- ción automática de la sangre periférica. A: colocación de la gota de sangre en el portaobjeto; b: desplazamiento del portaobjeto extensor para hacer el extendido de sangre periférica; C: rotulación de las placas con las muestras; D: coloración de los extendidos de sangre periférica. Cortesía de Sysmex®^.
A
C
B
D
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extendido será más largo y delgado y mientras mayor sea, el extendido será más corto y grueso.
6. Cuando la velocidad del movimiento de empuje es inapropiada. Mientras más lento sea el empuje de la gota de sangre, se producen más irregularidades en el extendido y más se afecta la distribución de las células en el extendido, dando resultados espurios. 7. Cuando la presión es inadecuada. Mientras mayor sea la presión, más delgado será el extendido. 8. Cuando en el medio ambiente del laboratorio clínico hay problemas con la humedad y temperatura. La humedad elevada puede hacer que las muestras se sequen con mayor lentitud y como consecuencia se produce distorsión de los eritrocitos.
Ventajas y desventajas del método del portaobjeto
El método del portaobjeto es el método más conocido y utilizado universalmente en los laboratorios clínicos y el que mejor se maneja por esta circunstancia. La técnica se domina con facilidad, los extendidos son menos frágiles que los que utilizan el método de la laminilla y se pueden manipular con mayor facilidad. Dentro de las desventajas está la falta de uniformidad en la distribución de los leucocitos que se logra con los métodos alternativos, situación que introdu- ce un índice de mayor variabilidad en los recuentos diferenciales manuales [48, 82].
Método de la laminilla
El método de la laminilla, también conocido como método del cubreobjeto, corresponde a una variable “mejorada” del método del portaobjeto, en donde el extendido en vez de hacerse sobre un portaobjeto estándar, se hace sobre laminillas o cubreobjetos.
Como en el método del portaobjeto, para lograr un extendido de sangre periférica de óptima calidad por el método de laminilla, es importante tener en cuenta la muestra, el material utilizado y el procedimiento propiamente dicho.
Muestra
Se puede hacer con sangre completa obtenida por punción digital o con sangre anticoagulada con EDTA (tubo con tapa lila para hemograma) [78]. Las muestras con heparina no son adecuadas para hacer el extendido de sangre periférica porque frecuentemente forma pequeños coágulos de plaquetas que interfieren con el análisis de la morfología plaquetaria y porque interfiere con la coloración, dando un fondo azul púrpura [79].
Material
Para lograr extendidos de sangre periférica de óptima calidad es indispensable utilizar lamini- llas de 22 mm, nuevas, de buena calidad, no las más baratas del mercado, limpias, libres de polvo y de grasa; y por ningún motivo, reutilizadas.
Procedimiento
Los pasos a seguir en el método de la laminilla para hacer el extendido de sangre periférica son los siguientes:
1. Tomar por una de sus esquinas una laminilla entre los dedos pulgar e índice de la mano izquierda, o derecha cuando quien hace el extendido es zurdo. Poner en el centro de una
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nes de controlar. Dentro de estas circunstancias, muy similar a lo que se puede presentar con el método del portaobjeto, en el método de laminilla las principales son las siguientes:
1. Cuando el extendido se hace con sangre con anticoagulante (usualmente con EDTA) y se almacena la muestra por períodos prolongados (más de dos horas) [79] o en condiciones inadecuadas, como puede suceder en los laboratorios clínicos con grandes volúmenes de trabajo o con sobrecarga de trabajo. Como resultado de esta circunstancia, se puede pre- sentar distorsión celular. 2. Cuando el extendido se hace con sangre sin anticoagulante y éste no se hace inmediata- mente después de colocar la gota de sangre sobre la laminilla. Si este proceso se retrasa, hasta cuando se inician los procesos de coagulación, las células más grandes, como los neu- trófilos y los monocitos, se localizan de manera desproporcionada y cuando se examinan al microscopio dan resultados espurios en el recuento diferencial de leucocitos. 3. Cuando se utilizan laminillas sucias o de mala calidad. Las laminillas deben estar libres de polvo y manchas de grasa. En algunos laboratorios clínicos con buenas prácticas de labora- torio, se limpian con alcohol las laminillas para hacer los extendidos de sangre periférica de rutina. No se deben utilizar laminillas extremadamente delgadas porque son muy frágiles y se quiebran durante el procedimiento, lo cual constituye un peligro para los profesionales del laboratorio [79]. 4. Cuando el tamaño de la gota de sangre es inapropiado. Una gota demasiado grande, la que usualmente desborda la capacidad de las laminillas, produce un extendido grueso y de pésima calidad en donde es imposible individualizar las células para el análisis de ellas. Una gota demasiado pequeña produce un extendido delgado e insuficiente para un estu- dio adecuado. 5. Cuando el desplazamiento de las laminillas no es adecuado. De ahí la mayor dificultad del método. 6. Cuando la presión aplicada entre las laminillas es inadecuada, mientras mayor sea la pre- sión más delgado será el extendido y, a la inversa, mientras menor sea la presión más grueso será el extendido. 7. Cuando en el medio ambiente del laboratorio clínico hay problemas con la humedad. La humedad elevada puede hacer que las laminillas se sequen con mayor lentitud y como consecuencia se produce distorsión de los eritrocitos.
Ventajas y desventajas del método de la laminilla
Con el método de la laminilla se logran extendidos de sangre periférica de óptima calidad pero se requiere experiencia para depurar y poner a punto la técnica, motivo por el cual sólo se utiliza en algunos servicios o laboratorios clínicos especializados en hematología. Con este método se obtiene una buena distribución de los leucocitos en todas las partes de la prepara- ción. A causa del menor tamaño de la muestra, se cuentan 50 leucocitos por cada cubreobjetos. Además de las cualidades antes descritas, que a su vez se convierten en inconvenientes para muchos laboratorios clínicos, sobre todo los de grandes volúmenes de pacientes, es más costoso que el método del portaobjeto, es más exigente en relación con la coloración, las laminillas son muchísimo más frágiles que los portaobjetos y, hasta el momento, no ha sido posible au- tomatizarlo. Finalmente, el “ Cytomentry Panel of the International Council for Standardization of Hematology (ICSH)”, debido a que las laminillas no pueden ser marcadas sin que se dañe el extendido y que la fragilidad del material puede representar un riesgo biológico para el personal
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del laboratorio, no lo recomienda y va más allá: lo considera obsoleto y en consecuencia no debería usarse [79].
Extendido de sangre periférica por el método de capas
Este método, también conocido como de spinner, consiste en utilizar una fuerza centrífuga para distribuir la sangre sobre la superficie de un portaobjeto [83-85]. Con este método se con- sigue una película de sangre muy delgada, por lo que también se le denomina monocapa, en la que es posible observar una distribución de los leucocitos muy uniforme haciendo innecesaria la selección de un área especial para hacer el recuento diferencial de leucocitos [83]. El sistema consta de una centrífuga especial, y unos receptáculos especiales para los portaobjetos, que con tan sólo dos gotas de sangre anticoagulada y en menos de tres a cinco segundos, permiten obtener extendidos de sangre periférica de óptima calidad. Esta metodología también puede ser utilizada para hacer extendidos de reticulocitos [86]. En la figura 10A se muestra una centrifuga para hacer extendido de sangre periférica por el método de capas y en la figura 10B , el adita- mento para manejar la muestra.
Ventajas y desventajas del método de capas
El método de capas usa una fuerza de centrifugación para producir una sola capa de células con leucocitos y plaquetas distribuidos uniformemente [87]. El método permite manejar grandes volúmenes de muestras con extendidos óptimos en donde se minimiza el daño de la morfología celular y el procedimiento es limpio y seguro. Tiene algunas desventajas como alteraciones de los eritrocitos por la fuerza centrífuga [84]. Otra desventaja es el riesgo biológico debido a que se pueden crear aerosoles, sobre todo cuando se utilizaban sistemas antiguos que carecen de la adecuada protección, y el costo del instrumento, además de que no está disponible en el medio por falta de representación comercial.
¿Cómo hacer una coloración del extendido de sangre
periférica de óptima calidad?
Además de la calidad del extendido de sangre periférica, el laboratorio clínico debe velar por la calidad de la coloración: para nada sirve un buen extendido si éste no se colorea adecuada- mente. Como en la mayoría de los procedimientos en el laboratorio clí- nico, sólo es posible tener resultados óptimos cuando las muestras son las adecuadas y los extendidos de san- gre periférica no son la excepción.
Independiente del método utili- zado para hacer el extendido de san- gre periférica y para colorearlo, de acuerdo con la ICSH la coloración de referencia para los extendidos de sangre periférica es la coloración de Romanowsky [88]. La coloración de Romanowsky es una mezcla que contiene azul de metileno y eosina que representa un prototipo de va- rias coloraciones entre las cuales sobresalen la coloración de Wright,
Figura 10. Extendido de sangre periférica por el método de capas. A: centrífuga utilizada para hacer el extendido de sangre periférica median- te el método de capas; b: aditamento para llevar la muestra de sangre a la centrífuga para hacer el extendido de sangre periférica. Cortesía de StatSpin DiffSpin ®^.
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Campuzano-Maya G.
Medicina & Laboratorio, Volumen 14, Números 3-4, 2008
Posibles problemas con la coloración
Una buena coloración debe mostrar un extendido de sangre periférica de color rosado. Si el extendido de sangre periférica una vez coloreado se observa azul, se deben considerar varias circunstancias: extendido de sangre periférica muy grueso, lavado insuficiente, tiempo de colo- ración prolongado y alcalinidad del colorante. Si la coloración queda roja puede ser por exceso de acidez en el colorante o en el agua utilizada, por presencia de humos ácidos en el colorante. Si en la coloración se observan precipitados entre las células puede ser debido a placas sucias, placas mal lavadas, a que el colorante se ha secado, posición oblicua del extendido de sangre periférica durante la coloración, polvo, incluido el procedente de guantes, precipitado sobre el extendido de sangre periférica y ambientes sucios en donde se colorean las placas, entre otras circunstancias.
Análisis del extendido de sangre periférica
Una vez que se tenga un extendido de sangre periférica de óptima calidad, debidamente coloreado, el punto final se centra en dos aspectos críticos: ¿quién y cómo analizar el extendido de sangre periférica?
¿Quién debe analizar el extendido de sangre periférica?
Para sacar el máximo provecho del examen del extendido de sangre periférica, el examen debe realizarlo personal idóneo, debidamente capacitado y preferiblemente con experiencia en morfología sanguínea [92]. Cuando en Europa y Estados Unidos sólo los laboratorios clínicos con personal capacitado y certificado pueden “leer” un extendido de sangre periférica, en nuestro
Figura 12. XE-Alpha®^ de Sysmex. Al lado izquierdo se observa un extensor y coloreador de placas modelo SP-1000i de Sysmex, incorporado al autoanalizador de hematología (DX-2100®^ ) ubicado al lado derecho. Cortesía de Sysmex®^.
¿Cómo obtener un extendido de sangre periférica de óptima calidad?
Medicina & Laboratorio, Volumen 14, Números 3-4, 2008
medio, sobretodo en algunos laboratorios de grandes volúmenes, el bacteriólogo se limita a “cargar” las muestras al autoanalizador de hematología y a entregar el impreso del estudio “en bruto”, sin el más mínimo análisis de las alarmas mediante un estudio microscópico de la sangre periférica, como claramente se evidenció en los facsímiles que se reprodujeron en las figuras 1 a 3 , en el curso de este módulo.
¿Cómo analizar el extendido de sangre periférica?
Finalmente, una vez obtenido un extendido de sangre periférica de óptima calidad, óptima- mente coloreado, es indispensable que sea analizado por personal calificado, conocedor de mor- fología sanguínea, como claramente se evidenció en el curso de este módulo, dentro de las bue- nas prácticas de laboratorio y como se analizará con detenimiento en los próximos módulos.
En la figura 13 se muestra un extendido de sangre periférica listo para ser leído en donde se delimitan algunas áreas de importancia, como la cabeza, el cuerpo y la cola del extendido, que el profesional que lee la placa debe identificar claramente. Como se esquematiza, el área en donde idealmente se debe hacer el análisis es la cola. Además, a manera de resumen, en las figuras 14 a 21 se muestran algunos ejemplos de extendidos de sangre periférica realizados por los diferen- tes métodos analizados en este módulo; como claramente se demuestra en las figuras 17 , 19 y 21 , con todos los métodos es posible tener buenos resultados cuando éstos se hacen siguiendo estrictamente los procedimientos para cada uno de ellos.
Figura 13. Extendido de sangre periférica listo para ser leído. Al lado izquierdo, sobre el portaobjeto se muestra un ex- tendido de sangre periférica realizado por un instrumento automático incorporado al autoanalizador de hematología en donde se identifican algunas áreas de importancia: En la cola del extendido se señala con una línea roja el área en donde idealmente debe centrarse el estudio microscópico. En el lado derecho se muestran algunos aspectos microscópicos de las principales áreas del extendido de sangre periférica. Fuente: laboratorio clínico institucional del orden asistencial de la ciudad de Medellín, Colombia.
10X 40X 100X
Cabeza
Cuerpo
Cola
